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上篇 动物细胞制药 贾茜 魏敬双 王辉 郑虹1

第1章 动物细胞制药历史沿革1

参考文献5

第2章 动物细胞制药的基本原理6

2.1 细胞培养的生物学6

2.1.1 起源和特性6

2.1.2 分化7

2.2 材料的选择7

2.2.1 细胞类型7

2.2.2 组织来源8

2.2.3 传代培养8

2.2.4 培养基9

2.2.6 培养系统10

2.2.5 气相10

2.3 培养过程11

2.3.1 基质11

2.3.2 培养基12

2.3.3 细胞培养13

参考文献15

第3章 用于制药的动物细胞17

3.1 用于蛋白药物生产的细胞系17

3.2 细胞的衰老和凋亡19

3.2.1 细胞凋亡的引发途径19

3.2.2 细胞凋亡的诱因20

3.2.3 细胞凋亡的预防21

3.2.4 培养物中衰老、凋亡和坏死细胞的检测22

3.3.2 血清和其他成分不确定的组织提取物在细胞培养系统中的作用24

3.3.1 概述24

3.2.5 细胞培养物中凋亡组分的测定24

3.3 无血清培养基24

3.3.3 反应曲线25

3.3.4 抗菌素、酚红、Hepes和光的作用27

3.3.5 组发纯度28

3.3.6 脂肪酸28

参考文献29

第4章 大规模培养——动物细胞生物反应器技术30

4.1 导论30

4.1.1 悬浮培养30

4.1.2 贴壁培养31

4.1.3 贴壁和悬浮细胞培养的普遍问题31

4.2.1 细胞数的测定32

4.2 常规方法与培养参数32

4.1.4 工业化细胞培养的发展趋势32

4.2.2 设备与试剂33

4.2.3 实际工作中应考虑的因素34

4.2.4 培养基与营养成分34

4.2.5 pH35

4.2.6 氧气36

4.2.7 培养类型38

4.2.8 限制放大的因素39

4.3 单层培养39

4.3.1 概述39

4.3.2 细胞贴壁40

4.3.3 放大41

4.4 悬浮培养47

4.4.2 静态悬浮培养48

4.4.1 悬浮培养的驯化48

4.4.3 小规模悬浮培养49

4.4.4 放大因素49

4.4.5 搅拌反应器51

4.4.6 连续流培养51

4.4.7 气升式反应器52

4.5 固定化培养53

4.5.1 禁锢培养方法53

4.5.2 截留培养54

4.5.3 多孔载体55

参考文献56

5.1.1 厂址选择58

5.1.2 对厂房的要求58

5.1 对厂房的要求58

第5章 动物细胞制药工艺58

5.1.3 空气洁净技术60

5.2 种子细胞的保存、复苏和鉴定61

5.2.1 细胞的冻存61

5.2.2 细胞系的鉴定64

5.3 产物的分离纯化69

5.3.1 蛋白纯化的放大69

5.3.2 细胞及细胞碎片的去除70

5.3.3 核酸的去除73

5.3.4 浓缩和初步纯化73

5.3.5 柱层析76

5.3.6 蛋白质纯化系统的放大83

5.3.7 蛋白质的稳定性84

5.4 制剂分装87

5.4.1 终产物的稳定性87

5.4.2 冻干88

5.4.3 贴标签和终产品的包装89

5.5 保存和运输89

参考文献90

第6章 动物细胞制药质量控制91

6.1 蛋白质的定性检测91

6.1.1 免疫印迹实验91

6.1.2 分子质量的测定92

6.1.3 蛋白质结构测定93

6.2 蛋白质的定量检测95

6.2.2 生物学活性测定(功能分析)96

6.2.1 免疫学测定96

6.2.3 蛋白的浓度测定97

6.3 蛋白质纯度分析98

6.3.1 聚丙烯酰胺凝胶电泳98

6.3.2 高压液相分析100

6.3.3 蛋白质中糖含量的分析100

6.3.4 残余宿主细胞蛋白及DNA含量分析101

6.3.5 牛血清蛋白残留量检测101

6.3.6 亲和层析脱落配基的检测101

6.4 对蛋白质药物制剂的质量控制102

参考文献103

第7章 动物细胞制药未来发展104

7.1 对宿主细胞的改造104

7.4 化学限定培养基的开发105

7.3 对发酵过程的控制105

7.2 动物细胞大规模培养方式的选择105

7.5 产品的质量和安全性106

7.5.1 对原材料的控制106

7.5.2 外源因子的清除106

7.5.3 规章、准则和药品生产质量管理规范107

7.6 展望107

参考文献107

下篇 转基因动物制药 刘思国 劳为德109

第8章 概论109

8.1 生物制药公司面临的生产问题109

8.1.1 生物医药开发的增长109

8.1.2 企业供应的制约因素109

8.2 转基因动物在生物工程制药中的地位110

8.3 转基因的最新成果111

8.4 当前的技术挑战111

8.4.1 启动区112

8.4.2 提高转基因的表达112

8.4.3 位置无关性112

8.4.4 新的长构件载体113

8.4.5 胚胎干细胞113

8.4.6 生产效率的优化113

8.4.7 细胞核移植114

8.5 结语115

第9章 产生重组蛋白质的不同动物系统116

9.1 从超级小鼠向转基因大家畜的延伸——动物生产性状的改良116

9.2.1 血液117

9.2 产生重组蛋白质的不同动物系统117

9.2.2 尿液118

9.2.3 精液118

9.2.4 蛋清118

9.2.5 蚕茧118

9.2.6 乳汁118

9.3 在转基因家畜的血液中表达重组蛋白119

9.4 在转基因家畜乳腺中生产人体蛋白质120

第10章 哺乳动物胚胎中遗传信息的导入125

10.1 生产用动物的选择125

10.2 转基因的方法126

10.3 当前应用的技术——直接向哺乳动物胚胎细胞核内微注射DNA127

10.3.1 供体动物的超排128

10.3.3 DNA的微注射129

10.3.2 卵的收集129

10.3.4 存活胚胎的转移130

10.3.5 转基因的整合130

10.3.6 转基因的表达132

第11章 乳蛋白基因的表达调控133

11.1 酪蛋白基因的表达调控133

11.1.1 核因子134

11.1.2 测定β-酪蛋白基因mRNA 3′-UTR序列结合蛋白137

11.1.3 3′-UTR涉及了β-酪蛋白基因的组织特异性表达的决定137

11.2 乳清蛋白——β-乳球蛋白和乳清酸蛋白基因的调控138

11.2.1 β-乳球蛋白的基因表达调控139

11.2.2 乳清酸蛋白基因的调控140

第12章 乳腺特异的转基因表达145

12.1 酪蛋白基础上的转基因乳腺特异表达145

12.1.1 牛的完整酪蛋白基因在转基因小鼠中的表达146

12.1.2 牛的asl和k酪蛋白基因在转基因小鼠中的表达分析147

12.1.3 酪蛋白基因簇的结构148

12.1.4 在转基因小鼠中重建牛的asl-/β-酪蛋白区域149

12.1.5 小结150

12.2 BLG基础上的转基因表达150

12.3 基于WAP的转基因乳腺表达152

12.4 总结154

第13章 乳腺生物反应器中基因的选择155

14.1.1 用于微注射的DNA溶液的准备159

14.1.2 YAC DNA微注射159

14.1.3 供体兔的准备和胚胎的收集159

14.1 转基因兔的产生159

第14章 几种动物的转基因制作过程159

14.1.4 兔卵的微注射160

14.1.5 注射后兔胚胎的移植及后代的产生160

14.1.6 产生转基因兔的效率161

14.1.7 转基因品系的建立及标记转基因的应用162

14.2 猪的转基因163

14.2.1 转基因猪作为个体制药系统的可行性163

14.2.2 转基因猪的生产164

14.3 转基因奶牛165

14.3.1 牛受精卵的来源165

14.3.2 原核注射165

14.3.3 胚胎的培养165

14.3.4 胚胎的性别鉴定和转基因检测165

14.3.5 胚胎移植和羊水分析166

15.1 通过核移植产生胚胎168

第15章 体细胞克隆方法生产转基因动物168

15.2 遗传物质导入(胚胎重建)169

15.2.1 重构胚胎的激活169

15.2.2 重构胚胎的培养169

15.2.3 重构胚的细胞周期同步170

15.2.4 供体细胞170

15.2.5 通过培养细胞生产转基因绵羊的过程170

15.3 影响细胞核移植效率的因子172

15.4 体细胞中的基因打靶172

15.5 畜类细胞的基因打靶173

15.6 基因打靶在大动物上的可能应用173

16.1 增多分子来源175

16.1.1 基因组序列175

第16章 转基因乳腺生物反应器的未来175

16.1.2 基因表达的控制176

16.2 体细胞修饰177

16.3 提高转基因效率178

16.3.1 获得适用的胚胎178

16.3.2 胚胎中导入外源DNA构件179

16.3.3 构件在基因组中的稳定整合180

16.3.4 处理后胚胎的转移和移植180

16.3.5 外源基因在转基因动物中的正确表达181

16.4 总结181

参考文献181

附录一 动物细胞制药常用设备及耗材供应商名录188

附录二 转基因技术大事记201

中文索引203

英文索引207