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目录1

译者序1

前言1

编著者名录1

第一章 聚乙二醇介导的烟草叶肉原生质体的转化：一个研究Cre与lox重组的实验　Michael K．Morgan和David W．Ow1

1．导论1

2．原生质体的制备7

3．聚乙二醇介导的转化8

4．荧光酶分析9

5．培养基的配制10

6．试剂的配制11

第二章 利用在玉米原生质体内的瞬时表达对一个植物转录因子进行功能分析　Leonard Rosenkrans，Vimla Vasil，Indra K．Vasil和Donald R．McCarty13

1．导论13

2．玉米悬浮培养细胞的维持培养16

3．原生质体的制备16

4．电击实验17

5．β-葡糖苷酸酶（GUS）的荧光测定19

6．培养基的制备20

7．试剂的配制22

第三章　用基因枪转化法将抗药基因导入烟草细胞　Pal Maliga24

1．导论24

2．待转化烟草XD细胞的制备30

3．外被DNA钨粉微粒的制备30

4．用PDS-1000/He型基因枪转化法将DNA导入烟草XD细胞31

5．β-葡糖苷酸酶（GUS）瞬时表达分析32

6．抗卡那霉素细胞系的选择33

7．培养基的制备34

8．试剂的配制35

第四章　烟叶盘片和农杆菌pPZP二元载体共培养构建转基因烟草植株　Zora Svab，Peter Hajdukiewicz和Pal Maliga37

1．导论37

2．利用三亲杂交将pPZP二元载体导入农杆菌43

3．烟叶盘片和农杆菌的共培养及抗性芽的鉴定45

4．β-葡糖醛酸酶（GUS）的组织化学鉴定47

5．转基因烟草幼苗中具有抗生素抗性表型植株的测试48

6．培养基的配制50

7．试剂的配制52

1．导论53

第五章　组织印迹法检测植物组织中的蛋白质和RNA Joesph E.Varner和Zheng-Hua Ye53

2．组织印迹的Western杂交56

3．组织印迹的Northern杂交57

4．试剂的配制59

第六章　固定和包埋植物组织中蛋白质的免疫定位 David C.Dixon和Daniel F.Klessig62

1．导论62

2．植物组织的甲醛固定和包埋66

3．包埋植物组织的切片和封固68

4．免疫染色69

5．试剂的配制71

第七章　用于检测植物组织RNA的原位杂交法 David C.Dixon，John R.Cutt和Daniel F.Klessig73

1．导论73

2．组织切片制备79

3．RNA探针的合成80

4．组织的预杂交处理84

5．杂交85

6．杂交后洗涤86

7．放射自显影87

8．染色88

9．试剂的配制89

第八章　向离体叶绿体内引入蛋白质 Gayle K.Lamppa92

1．导论92

2．体外转录98

3．在兔网织红细胞裂解液中进行体外翻译100

4．叶绿体的提取101

5．叶绿体中蛋白的引入103

6．引入产物的SDS-PAGE分析105

7．SDS-聚丙烯酰胺凝胶的放射自显影处理107

9．完整叶绿体的快速提取108

8．膜组分和内腔可溶性组分中放射性标记蛋白的量化108

10．试剂的配制109

第九章　显微注射与植物顶端组织发育模式的研究 Chris van der Schoot和William J.Lucas113

1．导论113

2．组织制备119

3．显微注射与染料偶联实验120

4．试剂的配制122

第十章　叶绿体连缀转录：叶绿体基因转录活性的测定 Xing-Wang Deng和William Gruissem124

1．导论124

2．从菠菜中分离完整的叶绿体127

3．连缀转录129

4．通过杂交定量连缀转录水平131

5．试剂的配制132

第十一章　叶绿体RNA的体外加工与用紫外交联分析RNA-蛋白质的相互作用 Gadi Schuster和Wilhelm Gruissem136

1．导论136

2．RNA的合成140

3．叶绿体mRNA 3′末端的体外加工142

4．蛋白质与RNA的交联144

5．试剂的配制147

1．导论152

第十二章　与DNA结合蛋白相作用的启动子序列的鉴定 Thianda Manzara和Wilhelm Gruissem152

2．番茄子叶细胞核的分离提取158

3．核抽提物的制备159

4．DNA片段的标记160

5．迁移率变动分析法163

6．DNase Ⅰ足迹分析法165

7．试剂的配制168

第十三章　测定蛋白质与DNA结合位点的电泳迁移率变动分析法 Ulrike Schindler和Anthony R.Cashmore172

1．导论172

2．放射性标记DNA探针的制备178

3．蛋白质与DNA结合反应180

4．非变性聚丙烯酰胺凝胶的制备181

5．试剂的配制182

第十四章　甲基化干扰法鉴定与蛋白结合的DNA位点 Ulrike Schindler和Anthony R.Cashmore185

1．导论185

2．放射性标记DNA探针的制备190

3．甲基化反应190

4．蛋白／DNA结合反应191

5．放射性标记DNA带的洗脱193

6．DNA片段的切割和变性PAGE分析194

7．试剂的配制196

第十五章　用原位筛选法分离编码序列特异性DNA结合蛋白的cDNA Ulrike Schindler和Anthony R.Cashmore198

1．导论198

2．放射性标记DNA探针的制备204

3．大肠杆菌感受态细胞的制备204

4．大肠杆菌的感染和蛋白合成的诱导204

5．变性、复性和封闭206

6．结合反应207

7．阳性噬菌斑的鉴定207

8．第二和第三轮筛选208

9．培养基的配制209

10．试剂的配制210

第十六章　DNA结合蛋白的磷酸化研究 Leszek J.Klimczak和Anthony R.Cashmore212

1．导论212

2．磷酸化化学计量的确定及磷蛋白形成动力学的测定216

3．用放射性标记的磷蛋白和非标记的DNA探针进行迁移率变动分析：磷酸化219

蛋白与DNA的结合219

4．用非标记的磷蛋白和放射性标记的DNA探针进行迁移率变动分析：磷酸化蛋白与DNA的结合220

5．生化计算举例223

6．试剂的配制224

第十七章 用连接介导PCR进行体内基因组足迹分析：比较在黑暗和光照条件下生长的番茄幼苗的RbcS3B启动子活性 Pedro Carrasco和Wilhelm Gruissem227

1．导论227

2．番茄幼苗子叶的DMS处理232

3．基因组DNA的小量制备……………………………………………………（232)234

4．基因组DNA的体外甲基化234

5．用哌啶进行甲基化DNA的化学裂解………………………………………（235)236

6．第一链的合成………………………………………………………………（235)236

7．接头-引物连接反应236

8．PCR扩增237

9．DNA的标记和最终PCR循环238

10．凝胶序列分析………………………………………………………………（240)241

11．预期结果241

12．试剂的配制…………………………………………………………………（241)245

第十八章　脉冲场凝胶电泳和酵母人工染色体解析拟南芥基因组 Callum J.Bell，Emilia Matallana，Patrick J.Dunn，Meiqing Lu，Kenneth Stark和Joseph R.Ecker245

1．导论…………………………………………………………………………（245)253

2．酵母DNA的微量制备………………………………………………………（252)253

3．大肠杆菌质粒拯救法制备YAC插入片段的末端序列253

4．用反向PCR回收YAC插入片段末端序列256

5．用PCR筛选YAC文库的序列标志位点260

6．筛选用于菌落杂交的YAC文库263

7．用琼脂糖包埋法制备酵母大分子量DNA267

8．钳位均匀电场电泳分析YACs268

9．杂交筛选YAC文库269

10．培养基的配制271

11．试剂的配制272

附录1　转基因植物试验规则277

附录2　材料来源和设备供应商278

索引283