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实验一 毒理学实验的基础知识与综合技能1

一、案例与问题1

二、毒理学实验概述1

三、毒理学实验规范与职业道德3

四、毒理学实验设计要求4

五、实验动物管理与实验者自身防护6

六、动物实验流程与基本操作技术7

七、思考题13

实验二 毒物代谢动力学研究与实验技术14

一、教学目的与意义14

二、背景资料14

三、案例与问题14

四、课题设计与实验指导15

课题名称：对硫磷与甲基对硫磷代谢动力学实验15

五、毒物代谢动力学试验主要方法与技术21

【题目】甲基对硫磷的代谢转化试验21

六、思考题24

实验三 一般毒性研究与实验技术25

一、教学目的与意义25

二、背景资料25

三、案例与问题26

四、课题设计与实验指导26

课题名称：氯胺嘧草醚的一般毒性试验与评价26

五、一般毒性试验主要方法与技术28

（一）急性经口毒性试验28

（二）急性吸入毒性试验33

（三）急性经皮毒性试验34

（四）亚慢性毒性实验35

（五）慢性毒性试验38

六、思考题40

实验四 遗传毒性研究与实验技术41

一、教学目的与意义41

二、背景资料41

三、案例与问题42

四、课题设计与实验指导42

课题名称：苯并（a）芘的遗传毒性测试与评价42

五、遗传毒性试验主要方法与技术43

（一）鼠伤寒沙门菌营养缺陷型回复突变试验43

（二）哺乳动物细胞基因突变试验47

实验1 小鼠淋巴瘤细胞L5178YTK+/-基因突变试验48

实验2 中国仓鼠肺V79(CHO)/hGPRT基因突变试验49

（三）小鼠骨髓细胞微核试验51

（四）染色体畸变分析52

实验1 体外哺乳动物细胞染色体畸变试验53

实验2 动物骨髓细胞染色体畸变试验55

（五）单细胞凝胶电泳试验56

六、思考题58

实验五 表观遗传毒性研究与实验技术59

一、教学目的与意义59

二、背景资料59

三、案例与问题59

四、课题设计与实验指导60

课题名称：某环境有害因素与表观遗传修饰改变的关联性研究60

五、表观遗传毒性实验主要方法与技术62

（一）DNA甲基化检测的主要方法和技术62

实验1 亚硫酸氢盐修饰结合甲基化特异性PCR62

实验2 亚硫酸氢盐修饰后测序64

（二）组蛋白修饰检测的主要方法和技术65

实验1 组蛋白特定位点修饰水平的检测——蛋白质印迹法65

实验2 组蛋白特定位点在基因富集水平的检测——染色质免疫共沉淀法67

（三）microRNA检测的主要方法和技术69

实验1 实时荧光定量PCR法检测microRNA表达69

实验2 双荧光素酶报告系统验证microRNA靶基因71

六、思考题72

实验六 致癌作用研究与实验技术73

一、教学目的与意义73

二、背景资料73

三、案例与问题74

四、课题设计与实验指导74

课题名称：NNK致癌作用测试及评价74

五、致癌作用实验主要方法与技术76

（一）细胞体外恶性转化实验76

（二）哺乳动物长期致癌实验81

（三）其他致癌实验84

六、思考题85

实验七 生殖发育毒性研究与实验技术86

一、教学目的与意义86

二、背景资料86

三、案例与问题86

四、课题设计与实验指导87

课题名称：镉及其化合物的生殖发育毒性评价87

五、生殖发育毒性试验主要方法与技术89

（一）生育力和早期胚体发育毒性试验89

（二）致畸试验90

（三）围生期发育毒性试验93

（四）一代（或二代）生殖毒性试验94

（五）精子质量分析96

（六）性激素水平的测定97

（七）外源化学物对大鼠睾丸间质细胞的损伤模型98

（八）外源化学物对大鼠卵巢颗粒细胞的损伤模型100

六、思考题101

实验八 纳米材料损害作用研究与实验技术102

一、教学目的与意义102

二、背景资料102

三、案例与问题103

四、课题设计与实验指导103

课题名称：纳米二氧化钛的毒性作用评价103

五、纳米材料损害作用试验主要方法与技术105

（一）纳米材料的前处理方法105

（二）纳米材料表面特征观察107

（三）纳米材料对细胞活力的影响108

（四）纳米材料急性经口毒性实验109

六、思考题111

实验九 电离辐射损害作用研究与实验技术112

一、教学目的与意义112

二、背景资料112

三、案例与问题112

四、课题设计与实验指导112

课题名称：电离辐射生物损伤效应特征及常用检测方法112

五、电离辐射损害作用试验主要方法与技术113

（一）核素溶液配制113

（二）铀矿尘对细胞增殖的影响115

（三）铀矿尘致支气管上皮细胞损伤的活性氧检测116

（四）电离辐射致DNA双链损伤的γ-H2AX含量变化检测117

六、思考题119

实验十 呼吸系统毒性研究与实验技术120

一、教学目的与意义120

二、背景资料120

三、案例与问题121

四、课题设计与实验指导121

课题名称：PM2.5急性肺毒性作用研究121

五、呼吸系统毒性试验主要方法与技术123

（一）潮气量和气流流速测定123

（二）胸内压测定124

（三）呼吸道液分泌功能测定——小鼠酚红排泄法124

（四）支气管肺泡灌洗液（BALF）分析125

（五）大鼠气道黏液中肺表面活性物质的测定128

（六）离体试验法128

实验1 离体肺灌流与分析128

实验2 离体气管片试验法129

实验3 乳鼠肺细胞原代培养与上皮细胞纯化130

实验4 体外培养的肺巨噬细胞中乳酸脱氢酶（LDH）活性测定131

六、思考题133

实验十一 肝脏毒性研究与实验技术134

一、教学目的与意义134

二、背景资料134

三、案例与问题134

四、课题设计与实验指导135

课题名称：评价未知化学物肝损害及探讨其毒性作用机制135

五、肝脏毒性试验主要方法与技术136

（一）肝损伤动物模型建立136

实验1 急性化学性肝损伤动物模型136

实验2 肝纤维化动物模型137

（二）肝脏亚细胞组分的制备138

实验1 肝脏微粒体的制备138

实验2 肝脏线粒体的制备139

（三）肝损害体内评价技术139

实验1 肝微粒体细胞色素P450含量的测定139

实验2 丙氨酸氨基转移酶（ALT）活性测定140

实验3 天冬氨酸氨基转移酶（AST）活性测定141

实验4 碱性磷酸酶（ALP）活性测定142

实验5 肝脏排泄功能测定143

实验6 肝脏分泌功能测定144

实验7 肝纤维化测定145

（四）肝损害体外评价方法146

实验1 离体肝脏灌流与分析146

实验2 肝细胞、Kupffer和Ito细胞的分离与培养148

实验3 肝细胞膜流动性检测150

实验4 肝细胞线粒体膜通透性检测151

实验5 肝细胞线粒体膜电位检测152

实验6 肝细胞线粒体呼吸功能检测153

实验7 肝细胞线粒体能量代谢功能检测155

六、思考题156

实验十二 肾脏毒性研究与实验技术157

一、教学目的与意义157

二、背景资料157

三、案例与问题158

（一）案例一158

（二）案例二158

四、课题设计与实验指导158

课题名称一：中药关木通引起大鼠肾脏毒性作用探讨158

课题名称二：综合评价百草枯急性中毒引起的肾脏毒性作用159

五、肾脏毒性试验主要方法与技术160

（一）尿液的一般生化指标测定160

（二）肾脏血流动力学和血流量分析161

（三）肾小球滤过率测定161

（四）血肌酐、尿素和尿酸浓度测定162

（五）肾浓缩稀释试验163

（六）形态学和酶组织化学检查163

（七）肾脏微灌注及微穿刺技术164

（八）肾皮质薄片培养及肾膜囊泡的分离与应用165

六、思考题166

实验十三 神经系统毒性研究与实验技术167

一、教学目的与意义167

二、背景资料167

三、案例与问题168

（一）案例一168

（二）案例二168

（三）案例三168

四、课题设计与实验指导168

课题名称一：评价MPTP对小鼠大脑多巴胺能神经元的损伤168

课题名称二：综合评价有机磷化合物的迟发性神经毒性169

课题名称三：正己烷神经毒性及机制探讨170

五、神经系统毒性试验主要方法与技术171

（一）实验动物神经行为学171

实验1 自主活动度检测（旷场试验）171

实验2 Morris水迷宫实验172

实验3 转棒试验（滚轴试验）173

实验4 后肢撑力实验173

实验5 抓力测定174

实验6 感觉神经功能174

方法1．鼠尾痛觉测定174

方法2．智能热板仪法175

（二）神经病理形态学方法175

实验1 神经细胞尼氏体染色175

实验2 免疫组化检测MPTP诱导的小鼠大脑多巴胺能神经元损伤（SP法）176

（三）周围神经传导速度测定178

（四）HPLC荧光法测定动物大脑兴奋性神经递质178

（五）大鼠海马组织突触膜谷氨酸受体的放射配体结合分析179

（六）神经元体外试验体系181

（七）有机磷农药的迟发性神经毒性评价181

六、思考题182

实验十四 免疫毒性研究与实验技术183

一、教学目的与意义183

二、背景资料183

三、案例与问题184

四、课题设计与实验指导184

课题名称：阿特拉津的免疫毒性检测与评价184

五、免疫毒性试验主要方法与技术185

（一）体液免疫检测185

实验1 溶血空斑实验185

实验2 血清中免疫球蛋白IgG和IgM的测定187

（二）特异性细胞免疫反应187

实验1 淋巴细胞增殖实验187

实验2 迟发型过敏反应（delayed-type hypersensi-tivity,DTH）188

实验3 细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte,CTL）活性的测定189

（三）非特异性细胞免疫反应189

实验1 NK细胞活性检测（乳酸脱氢酶释放法）189

实验2 巨噬细胞吞噬能力检测190

六、思考题191

实验十五 血液毒性研究与实验技术192

一、教学目的与意义192

二、背景资料192

三、案例与问题193

四、课题设计与实验指导194

五、血液毒性试验主要方法与技术195

（一）红细胞毒性检测195

实验1 网织红细胞计数195

实验2 红细胞渗透脆性试验196

实验3 高铁血红蛋白测定196

实验4 变性珠蛋白小体测定197

实验5 碳氧血红蛋白测定198

实验6 铁动力学试验199

（二）白细胞和血小板毒性检测199

实验1 白细胞墨汁吞噬试验199

实验2 血小板黏附试验200

（三）凝血功能毒性检测201

实验1 血浆凝血酶原时间测定201

实验2 活化部分凝血活酶时间测定202

（四）骨髓毒性检测203

实验1 骨髓细胞学检查203

实验2 外源性脾结节测定205

实验3 体内扩散盒琼脂培养技术206

实验4 骨髓微循环观察206

六、思考题207

实验十六 皮肤毒性研究与实验技术208

一、教学目的与意义208

二、背景资料208

三、案例与问题209

四、课题设计与实验指导210

课题名称：海娜粉皮肤毒理学安全性评价210

五、皮肤毒性试验主要方法与技术212

（一）皮肤刺激性／腐蚀性试验212

（二）急性眼刺激性／腐蚀性试验214

（三）皮肤变态反应试验217

（四）小鼠耳肿胀试验（mouse ear swelling test,MEST）219

（五）皮肤光毒性试验220

（六）皮肤光变态反应试验221

（七）人体斑贴试验222

（八）人体皮肤试用试验224

六、思考题225

实验十七 毒理学替代法的应用与实验技术226

一、教学目的与意义226

二、背景资料226

三、案例与问题227

（一）案例227

（二）问题228

四、课题设计与试验指导228

课题名称：用毒理学替代试验对化妆品原料——果酸的一般毒性和特殊毒性进行筛选和检测228

五、毒理学替代试验主要方法与技术228

（一）急性经口毒性替代试验——急性毒性分级法228

（二）皮肤腐蚀性替代试验——人重组皮肤模型试验232

（三）发育毒性替代试验——微团培养试验（the micromass test,MM Test）234

六、思考题239

实验十八 毒理学与公共卫生安全和管理实例分析240

一、教学目的与意义240

二、背景资料240

三、案例分析242

四、思考题247

参考文献248