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1.酶组织化学1

1.1 酶组织化学的原理及一般原则1

1.1.1 酶组织化学的基本原理1

1.1.2 酶组织化学的一般原则1

1.2 酶组织化学对组织处理的要求1

1.3 酶显示方法2

1.3.1 金属离子沉淀反应2

1.3.2 偶氮盐偶联反应2

1.3.3 靛蓝反应3

1.3.4 四唑反应3

1.4 酶组织化学的应用3

1.4.1 了解组织细胞的代谢活动3

1.4.2 细胞类型的判定3

1.4.3 细胞定位3

1.4.4 癌变过程的研究3

1.4.5 免疫组化和杂交组化的显示手段4

2.免疫组织化学5

2.1 免疫组织化学中的免疫化学5

2.1.1 抗原的提取和纯化5

2.1.2 合成肽的选择及半抗原的处理8

2.1.3 细菌超表达克隆化基因作为抗原的常用方法及原则9

2.1.4 抗体的制备9

2.1.5 抗体的标记12

2.2 组织细胞的处理13

2.2.1 组织细胞处理的重要性13

2.2.2 取材14

2.2.3 固定14

2.2.4 脱水16

2.2.5 包埋17

2.2.6 切片17

2.2.7 染色18

2.2.8 切片封固和保存18

2.3 石蜡组织切片中抗原性的修复18

2.3.1 蛋白酶消化修复18

2.3.2 热修复19

2.3.3 微波照射与蛋白酶消化联合应用20

2.4 免疫组织化学染色原理和方法21

2.4.1 免疫荧光法22

2.4.2 免疫酶法23

2.4.3 亲合免疫组化24

2.4.4 其他方法26

2.4.5 免疫组化染色阳性信号的原位放大27

2.5 非特异着色及对照的设置27

2.5.1 非特异着色及其消除方法27

2.5.2 对照设置29

2.5.3 增强对比度，提高染色效果30

2.6 双重或多重免疫组化30

2.6.1 常用的双标或多标记法30

2.6.2 消除双重染色间交叉反应的方法32

2.6.3 双标或多标记染色的注意事项32

2.7 免疫电子显微镜技术33

2.7.1 标记物33

2.7.2 包埋前法34

2.7.3 包埋后法36

2.7.4 不包埋法37

2.7.5 双标记或多标记法37

3.杂交组织化学39

3.1 杂交组织化学的原理39

3.2 探针类型、制备及标记40

3.2.1 探针的类型和制备40

3.2.2 探针的标记41

3.3 组织和细胞标本的制备46

3.4 原位杂交技术47

3.4.1 杂交前处理47

3.4.2 杂交48

3.4.3 杂交后处理49

3.4.4 对照49

3.5 原位PCR技术50

3.5.1 直接原位PCR50

3.5.2 间接原位PCR50

3.5.3 原位反转录PCR51

3.5.4 原位端粒重复序列扩增法51

3.6 杂交组织化学的进展51

3.6.1 双重或多重杂交组化技术51

3.6.2 杂交-免疫组化联合检测52

3.6.3 电镜下的杂交组化52

3.6.4 原位标记杂交52

4.现代组织化学定量技术54

4.1 图像分析技术概述54

4.2 图像处理和分析的基本原理54

4.3 图像分析的基本方法55

4.3.1 二维几何参数的测量55

4.3.2 灰度参数和光密度测量(图像细胞光度技术)56

4.3.3 其他56

4.3.4 激光扫描共聚焦显微镜56

4.4 图像分析和形态定量技术的应用前景57

5.现代组织化学的应用59

5.1 肿瘤诊断与鉴别诊断59

5.1.1 上皮性肿瘤59

5.1.2 淋巴瘤61

5.1.3 软组织肿瘤67

5.1.4 神经内分泌肿瘤69

5.1.5 肿瘤中雌、孕、雄激素受体70

5.1.6 肿瘤中癌基因和抗癌基因72

5.1.7 肿瘤细胞增殖活性75

5.2 免疫性疾病的诊断与研究76

5.2.1 常用免疫组化试剂77

5.2.2 免疫性损伤78

5.2.3 变态反应性疾病79

5.2.4 移植物排异反应81

5.3 细胞外基质的研究81

5.3.1 细胞外基质的成分81

5.3.2 细胞外基质的生成和降解84

5.3.3 细胞外基质的原位检测方法86

5.3.4 细胞外基质原位检测的应用88

5.4 病原生物体的检测90

5.4.1 病毒核酸及表达产物的定位90

5.4.2 细菌99

5.4.3 寄生虫和真菌100

5.5 细胞增殖、凋亡及其检测101

5.5.1 细胞增殖的检测101

5.5.2 细胞凋亡的表现及其调控101

5.5.3 细胞凋亡的诱导和抑制103

5.5.4 凋亡的检测103

5.5.5 细胞凋亡的医学意义106

6.现代组织化学的进展110

6.1 现代组织化学与显微切割技术110

6.1.1 显微切割技术的原理110

6.1.2 显微切割的方法110

6.1.3 显微切割后的细胞处理112

6.1.4 显微切割的应用112

6.2 组织芯片115

6.3 冷冻细胞阵列115

6.4 荧光及杂交组织化学新进展115

6.4.1 绿色荧光蛋白及其突变体116

6.4.2 荧光组织化学在探索新基因功能方面的应用116

6.4.3 绿色荧光蛋白与转基因及基因敲除动物117

6.4.4 绿色荧光蛋白与基因治疗119

6.4.5 活细胞荧光杂交120

7.常用现代组织化学实验指导123

7.1 酶组织化学实验123

7.1.1 葡糖-6-磷酸酯(G-6-P)：Wachstein-Meisel法123

7.1.2 γ-谷氨酰转肽酶(GGT):改良Albert法123

7.1.3 碱性磷酸酶(AP)：偶氮染料偶联法123

7.2 免疫组织化学实验124

7.2.1 免疫荧光法实验124

7.2.2 免疫酶法实验125

7.2.3 亲合免疫组化实验125

7.2.4 免疫电镜实验示教(包埋前-酶标直接法)126

7.2.5 ELPS法(二步法)检测乳腺癌雌激素受体(ER)127

7.3 杂交组织化学实验127

7.3.1 探针标记实验127

7.3.2 原位杂交130

7.4 形态定量实验(示教)132

7.4.1 细胞核二维几何参数的测量132

7.4.2 胶原免疫组化染色的定量133

附录Ⅰ134

一、标本的采集和处理134

1.活检组织134

2.手术切除和尸检标本134

3.细胞标本134

4.体外培养细胞134

5.实验动物组织标本134

二、石蜡切片制作流程134

三、冷冻切片制作流程135

1.组织冷冻135

2.冷冻切片机及切片135

四、HE染色及常用的衬染方法136

1.石蜡切片苏木精-伊红染色(HE染色)136

2.常用的衬染方法136

五、常用特殊染色方法简介136

1.胶原纤维染色法--van Gieson苦味酸和酸性品红法137

2.Masson结缔组织三色染色法137

3.Weigert弹力纤维染色法138

4.Gordon-Sweet网状纤维染色方法138

5.糖原染色--perodic acid schiff染色法(PAS法)138

6.基膜染色--六胺银法(periodic acid-silver methenamine,PASM法)139

7.AgNOR的石蜡切片染色法139

8.核酸染色--酸水解-无色品红法(Feulgen and Rossenbekk)140

六、常用固定液的配制140

1.4%甲醛溶液140

2.乙醇-醋酸-甲醛混合液140

3.中性缓冲甲醛固定液140

4.B-5固定液140

5.4%多聚甲醛固定液141

6.多聚甲醛-戊二醛(PG)固定液141

7.多聚甲醛-赖氨酸-过碘酸钠(PLP)固定液141

8.Carnoy固定液141

9.Bouin固定液141

10.Zenker固定液141

11.2.5%戊二醛固定液141

12.1%锇酸固定液141

13.其他固定液141

七、常用缓冲液的配制142

1.甘氨酸-HCl缓冲液(0.05mol/L)142

2.柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(0.1mol/L)142

3.Na2HPO4柠檬酸缓冲液142

4.磷酸缓冲液(PB，0.2mol/L)143

5.醋酸缓冲液(0.2mol/L)143

6.KH2PO4-NaOH缓冲液(0.05mol/L)143

7.巴比妥缓冲液143

8.Tris-HCl缓冲液(0.05mol/L)144

9.甘氨酸-NaOH缓冲液(0.05mol/L)144

10.碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液(0.1mol/L)144

11.二甲砷酸-HCl缓冲液(0.05mol/L)145

12.Tris-马来酸缓冲液(0.1mol/L)145

八、常用酶消化液配制145

1.0.1%胰蛋白酶(trypsin)消化液145

2.0.2%胃蛋白酶(pepsin)消化液145

3.0.05%链酶蛋白酶(pronase)消化液145

4.蛋白酶K(proteinase K)消化液145

九、免疫组化染色常用显色液145

1.3，3′-二氨基联苯胺(3，3′-diamino-benzidine,DAB)显色液145

2.4-氯-1-萘酚(4-chloro-1-naphthol,CN)显色液146

3.3-氨基-9-乙基咔唑(3-amino-9-ethylcarbazole,AEC)显色液146

4.NBT(nitro blue tetrazolium)和BCIP(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate)显色液146

十、常用组织切片粘附剂及使用方法146

1.白胶液146

2.多聚赖氨酸(poly-L-lysin,Sigma)146

3.3-氨丙基三乙氧基硅烷(3-aminopropyltrietoxysilane,APES)146

4.铬明矾明胶液146

5.甲醛-明胶液146

十一、水溶性封固剂--缓冲甘油明胶液147

附录Ⅱ148

重要相关网址148