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第1章 绪论1

1.1 基因工程的基本定义1

1.2 基因工程的诞生1

1.3 基因工程的发展历程3

1.4 基因工程的技术路线4

1.5 基因工程的研究内容5

1.5.1 克隆工具5

1.5.2 基因克隆技术6

1.5.3 目的基因6

1.5.4 基因工程的应用研究6

1.5.5 基因工程的安全性研究6

1.6 学习和研究基因工程的意义7

复习题8

第2章 基因工程的工具酶9

2.1 限制性核酸内切酶9

2.1.1 限制性内切酶的发现与分类9

2.1.2 限制性核酸内切酶的命名11

2.1.3 Ⅱ型限制性核酸内切酶的基本特性11

2.1.4 影响限制性核酸内切酶酶解反应的因素13

2.1.5 限制性核酸内切酶的应用14

2.2 DNA连接酶14

2.2.1 DNA连接酶的种类14

2.2.2 DNA连接酶的机理15

2.2.3 影响DNA连接酶的反应条件15

2.3 DNA聚合酶15

2.3.1 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ16

2.3.2 Klenow片段16

2.3.3 T4噬菌体DNA聚合酶17

2.3.4 T7噬菌体DNA聚合酶17

2.3.5 测序酶17

2.3.6 Taq DNA聚合酶17

2.3.7 反转录酶18

2.4 其他工具酶18

2.4.1 末端脱氧核苷酸转移酶18

2.4.2 T4多核苷酸激酶18

2.4.3 碱性磷酸酶19

2.4.4 单链核酸内切酶19

2.4.5 核酸外切酶19

2.4.6 甲基化酶20

复习题20

第3章 基因工程载体21

3.1 质粒22

3.1.1 质粒的基本生物学特性22

3.1.2 构建质粒克隆载体的策略23

3.1.3 质粒载体的构建24

3.1.4 质粒的种类和用途25

3.1.5 经典的大肠杆菌质粒载体26

3.1.6 质粒载体的稳定性问题29

3.2 噬菌体载体30

3.2.1 λ噬菌体载体30

3.2.2 M13噬菌体载体32

3.3 噬菌体-质粒杂合载体33

3.3.1 柯斯质粒载体33

3.3.2 噬菌粒载体35

3.4 人工染色体载体35

3.4.1 酵母人工染色体载体36

3.4.2 细菌人工染色体载体37

3.4.3 P1人工染色体载体37

3.4.4 哺乳动物人工染色体38

3.4.5 人类人工染色体38

3.4.6 植物人工染色体38

复习题39

第4章 受体细胞40

4.1 原核受体细胞40

4.1.1 大肠杆菌41

4.1.2 枯草芽孢杆菌41

4.1.3 蓝细菌41

4.2 真菌受体细胞42

4.2.1 酵母菌42

4.2.2 丝状真菌42

4.3 真核受体细胞43

4.3.1 植物细胞43

4.3.2 动物细胞45

复习题45

第5章 目的基因的制备46

5.1 直接分离法47

5.1.1 限制性内切酶酶切分离法47

5.1.2 利用酶促反转录法直接从特定mRNA分离基因47

5.1.3 机械方法47

5.1.4 物理化学法47

5.2 化学合成法48

5.2.1 化学合成法的原理48

5.2.2 化学合成法的步骤49

5.2.3 化学合成法的应用49

5.3 PCR扩增目的基因49

5.3.1 PCR反应特点50

5.3.2 PCR克隆目的基因51

5.3.3 PCR技术改造已知基因54

5.4 构建基因文库分离目的基因55

5.4.1 基因文库的构建56

5.4.2 基因文库构建的注意事项56

5.4.3 基因组文库与cDNA文库的区别58

5.4.4 克隆的鉴定方法59

5.5 根据基因的差异表达分离目的基因60

5.5.1 mRNA差别显示技术60

5.5.2 抑制性消减杂交60

5.5.3 酵母双杂交技术分离目的基因63

复习题64

第6章 DNA重组的操作65

6.1 重组子的构建65

6.1.1 相同黏性末端连接65

6.1.2 不同黏性末端的连接66

6.1.3 平末端连接67

6.1.4 修饰黏性末端连接67

6.1.5 PCR产物的连接68

6.1.6 影响外源DNA片段与载体DNA连接反应的因素70

6.2 重组DNA分子的转化和扩增71

6.2.1 Ca2+诱导转化71

6.2.2 电穿孔转化方法72

6.2.3 接合转化法72

6.2.4 λ噬菌体转导法73

6.2.5 转染73

6.2.6 转化率及其影响因素73

6.3 重组子的筛选与鉴定75

6.3.1 表型筛选法75

6.3.2 结构分析法78

6.3.3 限制酶谱分析筛选78

6.3.4 PCR扩增鉴定筛选79

6.3.5 目的克隆的鉴定80

复习题86

第7章 克隆基因在受体细胞中的表达调控87

7.1 克隆基因在原核细胞中的表达调控87

7.1.1 原核生物基因表达调控的特点88

7.1.2 原核生物基因表达的表达系统88

7.1.3 克隆基因在大肠杆菌中的表达调控89

7.2 外源基因在真核细胞中的表达98

7.2.1 真核生物基因表达与调控的特点98

7.2.2 真核细胞表达系统99

复习题109

第8章 转基因生物110

8.1 转基因植物110

8.1.1 转基因植物的技术路线110

8.1.2 目的基因的选择与克隆111

8.1.3 植物基因转化方法111

8.1.4 转基因植物的筛选和鉴定118

8.1.5 转基因植物中外源基因的沉默119

8.1.6 提高目的基因在转基因植物中的高效表达策略120

8.1.7 转基因植物的应用122

8.2 转基因动物123

8.2.1 转基因动物的基本操作过程123

8.2.2 转基因动物的制备技术124

8.2.3 外源基因导入动物细胞的方法124

8.2.4 转基因动物的鉴定132

8.2.5 转基因动物研究中出现的问题133

8.2.6 提高外源基因在动物中的表达效率的策略134

8.2.7 转基因动物的应用135

8.3 转基因微生物137

8.3.1 微生物基因工程的技术流程137

8.3.2 微生物基因工程的应用137

复习题138

第9章 基因工程的安全性139

9.1 转基因生物的安全性139

9.1.1 生物安全的含义与基本内容139

9.1.2 转基因生物的环境安全性140

9.1.3 转基因生物的健康性140

9.1.4 与基因工程产品安全性有关的重要事件141

9.2 生物安全政策、法规143

9.2.1 国际社会对基因工程的态度与规则143

9.2.2 我国基因工程安全管理措施144

9.3 转基因生物的安全性评价144

9.4 转基因生物的经济、伦理问题145

9.4.1 转基因生物与国际贸易和社会经济问题145

9.4.2 转基因生物的社会伦理问题146

复习题148

附录149

附录1 基因工程相关网站149

附录2 科研案例分析149

附录3 中英文名词解释183

参考文献193