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1日本七鳃鳗形态解剖学研究1

1.1引言1

1.1.1无颌类的形态特征1

1.1.2无颌类的食性2

1.1.3无颌类的生活史3

1.1.4无颌类的分类依据及我国的主要种类4

1.2日本七鳃鳗的研究价值6

1.2.1七鳃鳗化石与基因的研究揭示脊椎动物颌形成的机制7

1.2.2七鳃鳗脑的个体发育重演了脊椎动物脑的系统发育8

1.2.3七鳃鳗幼鳗的胰岛器官是脊椎动物胰岛器官系统发育的最简单阶段9

1.2.4小结10

1.3日本七鳃鳗消化系统形态学研究10

1.3.1材料和方法11

1.3.2结果11

1.3.3讨论13

1.4日本七鳃鳗消化系统组织学研究14

1.4.1材料和方法14

1.4.2结果16

1.4.3讨论18

1.5日本七鳃鳗消化系统组织化学研究19

1.5.1材料和方法19

1.5.2结果20

1.5.3讨论21

1.6日本七鳃鳗消化系统亚显微结构研究21

1.6.1材料和方法21

1.6.2结果22

1.6.3讨论24

1.7结论24

2日本七鳃鳗口腔腺表达序列标签分析26

2.1引言26

2.1.1EST技术简介26

2.1.2FST技术的研究方法27

2.1.3EST的主要应用32

2.1.4EST研究的局限性35

2.1.5七鳃鳗EST研究现状35

2.2日本七鳃鳗口腔腺cDNA文库的构建36

2.2.1材料与方法36

2.2.2结果40

2.2.3讨论40

2.3日本七鳃鳗口腔腺表达序列标签的获得与分析43

2.3.1材料与方法43

2.3.2结果44

2.3.3讨论48

2.4日本七鳃鳗口腔腺分泌物成分与EST序列的比对分析52

2.4.1材料和方法52

2.4.2结果54

2.4.3讨论54

2.5结论56

2.5.1完成了cDNA文库的后续处理和序列测定工作56

2.5.2完成了对所获表达序列标签的同源性比对分析57

3日本七鳃鳗肝脏表达序列标签分析与比较转录组研究58

3.1引言58

3.2日本七鳃鳗肝脏cDNA文库的构建与EST测序59

3.2.1材料与方法59

3.2.2 cDNA文库的质量鉴定60

3.2.3讨论60

3.3日本七鳃鳗肝脏表达序列表达标签（EST）分析61

3.3.1方法61

3.3.2结果与分析62

3.3.3讨论68

3.4结论74

3.4.1完成了cDNA文库的构建和后续序列测定工作74

3.4.2完成了对所获表达序列标签的生物信息学分析75

4日本七鳃鳗类淋巴细胞特异性免疫相关基因的差异表达76

4.1引言76

4.1.1无颌类脊椎动物免疫器官的进化76

4.1.2无颌类脊椎动物淋巴细胞的进化76

4.1.3无颌类脊椎动物免疫相关因子的研究77

4.1.4无颌类脊椎动物适应性免疫机制79

4.1.5限制片段差异显示聚合酶链反应在基因差异表达方面的研究80

4.1.6讨论80

4.2日本七鳃鳗类淋巴细胞的分离、纯化及细胞学特征81

4.2.1材料与方法81

4.2.2结果82

4.3日本七鳃鳗类淋巴细胞的异质性分析84

4.3.1材料与方法84

4.3.2结果85

4.3.3讨论86

4.4 RFDD-PCR方法分析日本七鳃鳗类淋巴细胞特异性免疫相关基因的差异表达87

4.4.1材料与方法87

4.4.2结果93

4.4.3讨论97

4.5结论98

4.5.1成功分离和纯化日本七鳃鳗的类淋巴细胞，并确定其单个核细胞层的最佳分离液相对密度为1.09298

4.5.2从细胞形态和组织化学研究等侧面分析了七鳃鳗类淋巴细胞的异质性98

4.5.3 RFDD-PCR方法建立日本七鳃鳗类淋巴细胞特异性免疫相关基因的表达谱并筛选得到VLR同源基因98

5脊椎动物激肰原基因的系统发育分析100

5.1引言100

5.1.1哺乳动物激肰原基因研究概况100

5.1.2非哺乳动物激肰原基因研究进展104

5.1.3小结104

5.2脊椎动物激肰原基因的系统发育分析105

5.2.1材料和方法105

5.2.2结果106

5.2.3讨论114

5.2.4小结116

5.3日本七鳃鳗肝脏组织中激肰原基因的克隆与分析117

5.3.1材料和方法118

5.3.2结果122

5.3.3讨论125

5.3.4小结126

5.4结论126

6日本七鳃鳗口腔腺分泌液纤溶酶活性及其组分的分离鉴定128

6.1引言128

6.1.1酶原型嵌合体纤溶酶——Pro-ACLF128

6.1.2特异识别纤维蛋白型嵌合体纤溶酶128

6.1.3抗凝血酶型嵌合体纤溶酶130

6.1.4抗血小板聚集型嵌合体纤溶酶——Fibro1ase嵌合体衍生物131

6.1.5抗凝血酶和抗血小板聚集型多效嵌合体纤溶酶131

6.1.6展望132

6.2日本七鳃鳗口腔腺分泌液纤溶酶及组织溶解活性的研究132

6.2.1材料和方法135

6.2.2结果140

6.3日本七鳃鳗口腔腺分泌液BGSP-1的纤溶酶活性的研究153

6.3.1材料与方法153

6.3.2结果154

6.4讨论158

6.5结论160

7三种重组七鳃鳗RGD毒素蛋白对HeLa、HepG2细胞的活性影响161

7.1引言161

7.1.1 RGD肰与整合素识别机制研究进展161

7.1.2有关Fgy400-411序列和Aa572-575（RGDS）序列在整合素介导的细胞黏附方面的研究163

7.1.3总结167

7.2重组七鳃鳗RGD毒素蛋白的生物信息学分析168

7.2.1方法168

7.2.2结果168

7.2.3讨论168

7.3七鳃鳗RGD毒素蛋白rLj-RGD1、rLj-RGD2、rLj-RGD3的表达／纯化与鉴定169

7.3.1材料与方法169

7.3.2结果172

7.3.3讨论174

7.4 rLj-RGDl、rLj-RGD2、rLj-RGD3的生物学活性175

7.4.1材料与方法176

7.4.2结果179

7.4.3讨论184

7.4.4结论185

8日本七鳃鳗口腔腺 Grimin基因的生物学活性研究186

8.1引言186

8.1.1 GRIM-19蛋白的基因特点及其在真核生物中的同源性186

8.1.2 GRIM-19的组织分布、细胞与染色体定位187

8.1.3 GRIM-19的生物学功能188

8.2日本七鳃鳗口腔腺新功能基因Grimin的克隆及序列分析191

8.2.1材料与方法191

8.2.2结果192

8.3 Grimin的诱导表达、鉴定与纯化194

8.3.1材料与方法194

8.3.2结果199

8.3.3讨论201

8.4 Grimin对人白血病细胞HL60及人脐静脉血管内皮细胞ECV304的生物学活性202

8.4.1材料与方法202

8.4.2结果204

8.5脂质体转染法转染人宫颈癌HeLa细胞和肝癌HepG2细胞后细胞凋亡活性的检测206

8.5.1材料与方法206

8.5.2结果209

8.5.3讨论211

8.6 Grimin多克隆抗血清的制取及效价测定212

8.6.1材料与方法212

8.6.2结果213

8.6.3讨论213

8.7结论215

9重组日本七鳃鳗口腔腺分泌L-250蛋白基因克隆及HRF活性鉴定216

9.1引言216

9.1.1 TCTP的空间结构特点217

9.1.2 TCTP合成的调控217

9.1.3 TCTP的生物学特性及功能218

9.1.4非哺乳动物TCTP的研究220

9.1.5日本七鳃鳗口腔腺分泌TCTP的研究221

9.2日本七鳃鳗口腔腺分泌L-250蛋白的基因克隆222

9.2.1材料和方法222

9.2.2结果224

9.3 TCTP的生物信息学分析225

9.3.1对TCTP蛋白系统演化关系进行分析225

9.3.2对rLj-TCTP蛋白的理化性质预测226

9.3.3对rLj-TCTP蛋白的结构特征预测227

9.3.4对rLj-TCTP蛋白的三级结构预测230

9.4重组日本七鳃鳗口腔腺分泌L-250蛋白的诱导表达、鉴定与纯化231

9.4.1材料与方法231

9.4.2结果234

9.4.3讨论235

9.5兔抗七鳃鳗血清L-250蛋白多克隆抗体的制备与免疫印迹分析236

9.5.1材料和方法236

9.5.2结果238

9.5.3讨论239

9.6日本七鳃鳗口腔腺分泌L-250蛋白的HRF活性240

9.6.1材料和方法240

9.6.2结果241

9.6.3讨论242

9.7 rLj-TCTP蛋白刺激大鼠腹腔肥大细胞释放组胺244

9.7.1材料与方法244

9.7.2结果246

9.7.3讨论247

9.8 rLj-TCTP对HUVEC、HeLa细胞增殖及其凋亡的影响247

9.8.1材料与方法247

9.8.2结果250

9.8.3讨论253

9.9结论255

10日本七鳃鳗口腔腺分泌蛋白L251的表达纯化及生物学活性鉴定256

10.1引言256

10.1.1 CRISP家族蛋白成员及其分布256

10.1.2 CRISP家族蛋白的结构特点259

10.1.3 CRISP家族蛋白的功能260

10.1.4 CRISP的应用展望262

10.2基因序列进化分析，L251蛋白的表达及纯化262

10.2.1材料和方法262

10.2.2结果266

10.2.3讨论272

10.3中性粒细胞跨血管内皮细胞迁移273

10.3.1材料和方法273

10.3.2实验结果274

10.3.3讨论275

10.4跨HUVEC单层细胞膜迁移实验277

10.4.1材料与方法277

10.4.2结果281

10.4.3讨论284

10.5 L251对中性粒细胞呼吸爆发的抑制285

10.5.1材料和方法285

10.5.2结果287

10.5.3讨论288

10.6 L251对中性粒细胞表面整合素表达的影响289

10.6.1材料和方法289

10.6.2结果290

10.6.3讨论292

10.7 MTT法检测L251对T淋巴细胞增殖抑制293

10.7.1材料和方法293

10.7.2结果294

10.7.3讨论295

10.8细胞周期法检测T淋巴细胞增殖抑制296

10.8.1材料与方法296

10.8.2结果297

10.8.3讨论299

10.9结论300

参考文献302