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第一章　基础篇1

第一节 分子生物学实验室常用基本器具1

一、常用基本器具1

二、常用器具的材料5

第二节　通用实验设备及其使用方法8

一、天平8

二、pH计10

三、分光光度计10

四、微量移液器11

五、离心机13

六、恒温箱15

七、振摇器16

八、超净工作台18

第三节　实验室基础准备工作18

一、实验用水的制备18

二、消毒灭菌20

三、液氮的使用23

四、实验器具的硅化24

五、实验用醇及酚类的准备25

第四节　实验用试剂27

一、分子生物学实验室常用试剂浓度表示法27

二、试剂的保存28

三、实验室中试剂的管理28

第五节　安全防护28

一、放射性核素的防护28

二、危险化学试剂及防护29

三、生物安全防护30

第二章　核酸的基础理论31

第一节　核酸31

一、核酸的组成与结构31

二、核酸的理化特性36

三、核酸的光谱学38

四、核酸的降解与合成39

第二节　基因与染色体41

一、基因41

二、染色体46

第三节　细胞分裂周期51

一、有丝分裂51

二、减数分裂53

第四节　遗传信息的传递57

一、复制57

二、转录60

三、翻译66

第三章　核酸的制备70

第一节　真核细胞DNA的制备70

一、概论70

二、从培养的动物细胞或组织中提取高分子质量DNA73

三、血液样品中DNA的制备76

四、残存蛋白质和RNA的检测77

五、真核细胞基因组DNA制备中的注意事项78

第二节 细菌细胞DNA的提取78

一、试剂78

二、实验流程79

三、制备大分子质量细菌DNA的几个关键步骤79

第三节　质粒DNA的分离纯化80

一、概论80

二、氯化铯密度梯度离心法82

三、碱裂解法83

四、煮沸法85

五、试剂盒提取及纯化质粒85

第四节　RNA的制备86

一、RNA的结构和分布86

二、RNA制备中的关键因素89

三、组织细胞总RNA分离制备91

第四章　电泳技术94

第一节 电泳技术的基本原理94

第二节　影响泳动率的因素95

一、样品95

二、支持介质95

三、电场强度96

四、缓冲液的离子强度97

第三节 凝胶电泳的基本技术和条件97

一、核酸凝胶电泳的分类97

二、缓冲液系统98

三、样品的配制99

四、电泳条件的考虑100

五、染色100

六、电泳结果的记录101

第四节　琼脂糖凝胶电泳102

一、仪器设备及材料103

二、电泳操作步骤104

第五节　碱性琼脂糖凝胶电泳106

第六节 聚丙烯酰胺凝胶电泳107

一、仪器设备及试剂108

二、制胶准备109

三、制胶110

四、电泳111

五、染色及结果观察111

第七节 双向电泳111

一、等电聚焦电泳113

二、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳122

三、双向电泳结果的分析鉴定127

第八节 凝胶扫描、成像系统131

第五章　工具酶133

第一节　限制性内切酶133

一、概述133

二、常用的三种内切酶135

三、其他类型内切酶138

四、甲基化酶139

五、与内切酶相关的几个概念140

六、限制性内切酶酶切反应142

七、DNA分子的限制性内切酶酶谱143

第二节　DNA重组常用的其他酶类145

一、DNA聚合酶145

二、RNA聚合酶147

三、DNA连接酶147

四、反转录酶148

五、核糖核酸酶A148

六、核糖核酸酶T1148

七、核糖核酸酶H149

八、核糖核酸酶U2、核糖核酸酶CL3149

九、脱氧核糖核酸酶Ⅰ149

十、核酸酶S1149

十一、核酸酶Ba131149

十二、核酸外切酶149

十三、末端转移酶150

十四、多核苷酸激酶150

十五、碱性磷酸酯酶150

第六章　基因克隆技术151

第一节 目的基因DNA的制备151

一、从染色体中获得151

二、人工合成153

三、聚合酶链式反应扩增特定的基因片段153

第二节　基因克隆载体153

一、质粒154

二、噬菌体162

三、真核细胞为宿主的克隆载体171

四、反转录病毒载体178

第三节 DNA分子的体外重组179

一、DNA连接酶179

二、外源性基因DNA片段与载体DNA的连接182

三、影响DNA连接的因素187

四、DNA在凝胶内的连接187

第四节　重组DNA导入宿主细胞188

一、转化的方法189

二、氯化钙法转化大肠杆菌（全部过程需无菌操作）190

三、重组DNA克隆的筛选与鉴定191

第五节　基因组文库的构建195

一、构建基因文库的准备条件196

二、基因文库的构建199

第六节　cDNA文库的构建207

一、总RNA的提取及mRNA的制备207

二、cDNA文库的构建209

第七章　聚合酶链式反应215

第一节　PCR基本原理215

一、基本原理215

二、“长产物片段”与“短产物片段”217

三、平台效应217

第二节　PCR反应条件的优化219

一、标准PCR反应流程219

二、PCR反应条件的优化220

第三节　引物的设计224

一、设计原则224

二、引物长度224

三、引物的5端修饰法225

四、简并引物226

五、嵌套引物228

第四节 PCR反应模板的制备228

第五节　耐热DNA聚合酶229

一、Taq DNA聚合酶229

二、其他耐热DNA聚合酶232

第六节　热启动PCR233

一、热启动PCR的原理233

二、热启动PCR的几种技术233

第七节　降落PCR235

第八节 PCR相关技术的发展236

一、不对称PCR237

二、多重PCR238

三、着色互补PCR239

四、巢式PCR239

五、锚定PCR240

六、反向PCR240

七、锅柄PCR242

八、增敏PCR242

九、重组PCR242

十、表达PCR244

十一、原位PCR244

十二、RNA的聚合酶链反应245

十三、cDNA末端快速扩增246

十四、差异显示PCR251

十五、定量PCR251

第九节　PCR产物的检测260

一、琼脂糖凝胶电泳260

二、聚丙烯酰胺凝胶电泳260

三、层析技术261

四、分子杂交261

五、微孔板夹心杂交法261

六、限制性内切酶酶切分析261

七、酶免疫法检测PCR262

八、PCR扩增产物的直接测序262

第十节　PCR的污染及对策263

一、PCR污染263

二、污染的预防263

三、对照实验263

四、污染源的处理264

第十一节　PCR技术的应用265

一、基因分析265

二、定序克隆270

三、序列分析271

第八章　核酸分子探针的标记273

第一节　概述273

一、探针的种类及其选择273

二、各种标记物及其选择274

三、各种标记方法及其选择278

第二节 非放射性DIG标记方法279

一、非放射性DIG标记方法的比较279

二、PCR标记法280

三、随机引物标记法283

四、体外转录标记RNA探针285

五、三种标记方法重要参数的比较简表289

第三节 探针标记效率的评估289

一、直接检测过程290

二、琼脂糖凝胶电泳分析PCR标记探针290

第九章　核酸分子杂交292

第一节　Southern杂交292

一、琼脂糖凝胶分离DNA样品292

二、DNA的转膜（Southern印迹、虹吸印迹法）293

三、预杂交295

四、DIG标记的DNA探针与靶DNA的杂交296

第二节 RNA探针的Northern杂交300

一、琼脂糖凝胶分离RNA样品300

二、RNA的转膜（Northern印迹，虹吸印迹法）302

三、预杂交302

四、DIG标记的RNA探针与RNA的杂交303

五、做核酸杂交时，如何取得良好结果304

第三节 非放射性核素探针的检测305

一、光学检测305

二、化学发光检测307

第四节　使用DIG标记的探针进行菌落和噬菌斑的杂交309

一、菌落／噬菌斑滤膜的准备步骤309

二、DIG标记的DNA探针与菌落／噬菌斑滤膜的杂交310

三、化学发光法检测探针-靶基因杂交信号311

四、显色法检测探针-靶基因杂交信号311

五、菌落／噬菌斑杂交的影响因素312

第五节　核酸原位杂交312

一、核酸原位杂交的基本要点312

二、结果的评定315

附：Western印迹检测表达蛋白质315

一、哺乳细胞的裂解316

二、蛋白质的电转移316

三、封闭317

四、靶蛋白与第一抗体反应317

五、与第二抗体反应317

六、显色318

第十章　测序319

第一节　概论319

第二节　Sanger双脱氧法320

一、基本原理320

二、经典测序反应——M13单链测序系统322

三、双链DNA测序反应系统330

四、循环测序法333

五、PCR产物直接测序335

第三节 Maxmam-Gilbert化学法338

一、化学法基本原理338

二、化学法测序的一般流程338

三、化学法的优缺点341

第四节　杂交测序342

第五节 自动化测序345

一、自动化测序仪345

二、全自动化测序流程351

第六节 DNA大片段序列测定的战略356

一、随机测序356

二、定向测序法360

三、全基因组测序策略362

第七节 DNA测序技术新进展364

第十一章　新技术368

第一节　mRNA差异显示技术368

一、概述368

二、基本原理371

三、实验设计和优化372

四、实验操作378

五、差异显示技术衍生的方法386

六、差异显示技术的应用387

七、存在的问题和解决的策略394

八、展望395

第二节　生物芯片396

一、生物芯片技术的基本原理397

二、生物芯片技术的特点397

三、生物芯片的应用398

四、生物芯片技术存在的问题及发展前景400

第三节 激光捕获纤维切割技术402

一、LCM技术的主要原理及简单操作402

二、LCM技术的特点、存在问题及相应对策403

三、LCM技术在生命科学研究中的应用状况404

四、LCM技术的发展前景405

第四节 小干扰RNA406

一、siRNA的作用机制406

二、siRNA的特点406

三、siRNA技术的关键步骤407

四、siRNA的应用408

五、不足与展望410

第十二章 生物信息学及其在分子生物技术中的应用412

第一节 概述412

一、生物信息学的概念412

二、生物信息学的发展413

三、生物信息学的研究现状415

第二节 生物信息学的研究方法和内容417

一、研究方法417

二、研究内容431

第三节　生物信息数据库435

一、生物信息数据库及其分类435

二、生物信息数据库介绍436

三、数据库的查询438

四、全球生物信息数据库439

第四节　序列比对和数据库搜索450

一、序列比对450

二、数据库搜索451

第五节 生物信息学的应用454

一、序列分析454

二、核酸序列装配和拼接461

三、电子基因定位462

四、基因表达的电子组织分布464

五、功能预测464

六、蛋白质结构预测467

七、向数据库提交序列468

八、SNP分析469

九、蛋白质组数据分析469

第六节　研究实例472

一、实例一472

二、实例二476

三、实例三477

四、其他研究路线478

第十三章　蛋白质组学相关技术481

第一节　概述481

一、蛋白质组学产生的背景及概念481

二、蛋白质组学的主要研究内容482

三、蛋白质组学的研究方法482

四、蛋白质组学的发展趋势484

第二节 蛋白质提取与样品制备484

一、离液剂、表面活性剂及还原剂的选择484

二、细胞蛋白质样品的制备485

三、体液蛋白质样品的制备485

四、组织细胞蛋白质样品的制备486

第三节　蛋白质组分离技术488

一、双向电泳及荧光差异双向电泳488

二、高效液相色谱490

三、毛细管电泳及毛细管电色谱491

第四节　质谱技术491

一、基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱491

二、电喷雾电离质谱492

第五节 蛋白质芯片技术493

一、表面增强激光解吸／离子化蛋白质芯片技术493

二、液体芯片-飞行时间质谱技术——CLINPROT系统494

三、抗体芯片494

第十四章　细胞培养技术496

第一节 细胞培养室和基本设备准备496

一、细胞培养的设备和器具496

二、实验器材的处理及消毒497

第二节　培养用液498

一、水与平衡盐溶液498

二、培养液499

三、体外培养的其他常用液500

第三节 原代培养和传代培养501

一、原代培养的过程501

二、传代培养的过程503

第四节 培养物的冻存与复苏503

一、冷冻保存方法503

二、冻存细胞的复苏504

第五节　正常细胞培养504

一、鼠成纤维细胞的分离与培养504

二、上皮细胞的培养505

三、成骨细胞的培养506

四、胎鼠大脑皮质神经元的培养507

第六节　肿瘤细胞的培养508

一、肿瘤组织细胞的原代培养508

二、肿瘤细胞的传代511

三、肿瘤细胞的克隆培养法511

四、肿瘤细胞系513

第七节　干细胞培养513

一、人骨髓间充质干细胞的分离培养513

二、小鼠胚胎干细胞（embryonic stem cell,ES）的体外培养及分化514

三、大鼠胚胎大脑海马神经干／祖细胞培养516

四、人脑肿瘤干细胞（brain tumor stem eells,BTSC）分离和培养517

附录521

一、遗传密码子表521

二、常用的缓冲液和试剂521

三、铬酸洗液及配制方法528

四、放射性核素资料529

五、核酸及蛋白质数据530

六、常用分子质量标准参照物531

七、细胞培养中出现的常见问题、原因及解决方法533

八、分子生物学研究中的网上资源534

缩略语535

索引540