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第一章 生物化学与分子生物学中的定量分析1

第一节 滴定分析法1

一、 基本原理1

二、 标准溶液3

三、 滴定分析的计算5

四、 减少滴定误差的方法6

第二节 紫外可见分光光度法7

一、 基本原理7

二、 分光光度计的主要部件9

三、 分光光度法的定性和定量10

四、 减少测量误差的方法11

第三节 荧光分析法12

一、 基本原理12

二、 荧光仪的主要部件13

三、 荧光分析法的定性和定量13

四、 减少测量误差的方法14

第四节 酶活力及动力学数据的测定15

一、 酶活力的测定15

二、 KM和VMAX的测定18

三、 基本动力学数据的测定19

实验1-1 粗脂肪的提取和定量测定20

实验1-2 碘价的测定(Hanus法)21

实验1-3 皂化价的测定22

实验1-4 酸价的测定23

实验1-5 脂肪乙酰价的测定24

实验1-6 蛋白质的测定(凯氏定氮法)25

实验1-7 2，6-二氯酚靛酚法测定维生素C的含量26

实验1-8 碘量法测定维生素C的含量28

实验1-9 血糖定量测定(GOD-PAP法)29

实验1-10 蒽酮比色定糖法30

实验1-11 肝素钠的容量测定30

实验1-12 血清胆固醇的定量测定(磷硫铁法)32

实验1-13 血清总胆固醇的测定(邻苯二甲醛法)33

实验1-14 双缩脲法测定蛋白质含量33

实验1-15 Folin试剂法(Lowry法)测定蛋白质含量34

实验1-16 考马斯亮蓝染色法测定蛋白质含量35

实验1-17 紫外吸收法测定蛋白质含量36

实验1-18 紫外吸收法测定核酸含量37

实验1-19 二苯胺显色法测定DNA含量38

实验1-20 地衣酚显色法测定RNA含量39

实验1-21 定磷法测定核酸含量40

实验1-22 荧光法测定维生素B2含量42

实验1-23 枯草芽孢杆菌蛋白酶活力测定43

实验1-24 血清丙氨酸氨基移换酶(ALT)的测定44

实验1-25 酸性磷酸酯酶的测定46

实验1-26 碱性磷酸酶的反应动力学性质46

第二章 生物大分子的提取、沉淀和离心分离49

第一节 生物大分子的提取49

一、 材料的选择与处理49

二、 确定测定方法50

三、 细胞的破碎50

四、 抽提52

第二节 沉淀分离技术54

一、 蛋白质的沉淀分离54

二、 核酸的提取与沉淀分离57

第三节 离心分离技术59

一、 离心机的种类与用途59

二、 离心分离方法的选择60

三、 离心条件的确定61

实验2-1 醇脱氢酶的提纯63

实验2-2 大蒜细胞SOD的提取与分离65

实验2-3 大鼠肝rRNA的提取与分离66

实验2-4 枯草芽杆孢菌碱性磷酸酶的提取与盐析67

实验2-5 枯草芽孢杆菌DNA的提取与分离69

实验2-6 酵母RNA的提取与分离70

实验2-7 从肝脏中提取DNA71

实验2-8 大肠杆菌细胞膜的分离72

实验2-9 RNA的蔗糖密度梯度离心分离73

实验2-10 大鼠肝细胞核的分离74

第三章 层析技术75

第一节 吸附层析75

一、 吸附柱层析76

二、 聚酰胺薄膜层析80

第二节 分配层析80

一、 概述80

二、 纸层析81

第三节 凝胶层析85

一、 基本原理85

二、 凝胶的选择86

三、 操作87

第四节 离子交换层析88

一、 基本原理88

二、 离子交换剂89

三、 操作92

第五节 亲和层析94

一、 配基与偶联凝胶的选择与处理95

二、 亲和层析的操作条件96

第六节 薄层层析96

一、 支持剂的选择与处理96

二、 薄层板的制作97

三、 层析方法98

第七节 气相色谱99

一、 基本原理99

二、 气相色谱的气路系统100

三、 色谱柱101

四、 检测器102

五、 定性和定量方法103

第八节 高效液相色谱104

一、 概述104

二、 HPLC的特点104

三、 HPLC的分类105

四、 HPLC的仪器构成107

五、 定性定量方法107

实验3-1 氨基酸的纸层析108

实验3-2 微晶纤维素薄板层析法分离氨基酸109

实验3-3 核苷酸的离子交换层析110

实验3-4 DNS-氨基酸的聚酰胺薄膜层析112

实验3-5 凝胶层析测定蛋白质的Mr113

实验3-6 鸡卵类黏蛋白的制备115

实验3-7 胰蛋白酶的亲和层析118

实验3-8 醇酯成分的气相层析120

实验3-9 HRLC法测定生物类黄酮含量121

实验3-1O HPLC法测定维生素A含量122

实验3-11 HPLC法测定维生素D含量124

第四章 电泳技术126

第一节 基本原理126

一、 泳动度126

二、 影响泳动度的因素127

第二节 醋酸纤维素薄膜电泳128

第三节 琼脂糖凝胶电泳129

一、 琼脂糖凝胶的特点129

二、 DNA的琼脂糖凝胶电泳129

三、 印迹转移电泳131

四、 交变脉冲电场凝胶电泳132

第四节 聚丙烯酰胺凝胶电泳133

一、 聚丙烯酰胺凝胶的特点133

二、 凝胶聚合的原理及有关特性133

三、 PAGE原理135

四、 SDS-PAGE原理137

五、 聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳原理138

六、 聚丙烯酰胺凝胶双向电泳原理142

七、 染色方法142

第五节 高效毛细管电泳146

一、 基本原理146

二、 实验方法147

三、 分离类型及应用148

实验4-1 血清蛋白的醋酸纤维素薄膜电泳149

实验4-2 垂直板PAGE分离血清蛋白151

实验4-3 SDS-PAGE测定蛋白质的相对分子质量153

实验4-4 SDS-PAGE的银染色法155

实验4-5 水平超薄型IEF-PAGE156

实验4-6 蛋白质的双向凝胶电泳159

实验4-7 DNA的琼脂糖凝胶电泳160

实验4-8 PAGE分离RNA161

实验4-9 对流免疫电泳法测定胎儿甲种球蛋白162

实验4-10 火箭免疫电泳法测定抗原含量164

第五章 分子生物学基本技术165

第一节 DNA的体外合成165

一、 DNA的化学合成165

二、 聚合酶链反应技术166

第二节 核酸的分子杂交170

一、 探针的种类与选择171

二、 标记物的选择171

三、 探针的放射性同位素标记175

四、 探针的非放射性标记176

五、 膜上印迹杂交的条件选择176

六、 杂交信号的检测179

第三节 基因克隆181

一、 目的基因的来源181

二、 常用的克隆载体182

三、 DNA分子的体外连接184

四、 重组子导入受体细胞186

五、 重组子的筛选186

六、 基因组文库的构建188

七、 CDNA文库的构建190

第四节 基因表达191

一、 原核生物的表达载体191

二、 用于原核细胞表达的外源基因193

三、 提高表达水平的措施193

四、 外源基因的哺乳动物细胞中的表达197

五、 转基因植物200

第五节 转录调控研究技术201

一、 基因功能状态的研究方法201

二、 顺式作用元件与反式作用因子的分析方法203

实验5-1 血液标本中DNA的提取205

实验5-2哺乳动物基因组DNA的提取206

实验5-3mRNA提取与纯化207

实验5-4脉冲电场电泳分离DNA209

实验5-5大肠杆菌的转化210

实验5-6质粒DNA的提取210

实验5-7质粒DNA的酶切及电泳鉴定212

实验5-8质粒DNA的分子杂交213

实验5-9使用光敏生物素探针的Southern杂交215

实验5-1ODNA重组217

实验5-11PCR扩增DNA218

实验5-12反转录聚合酶链反应(RT-RCR)219

实验5-13外源基因在大肠杆菌中的诱导表达220

附录常用缓冲液的配制221