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第一篇 生物化学与分子生物学实验概论3

第1章 生物化学与分子生物学实验的基本要求3

第一节 实验室的基本要求3

一、实验室规则3

二、实验室安全3

第二节 实验记录与实验报告的基本要求5

一、实验记录5

二、实验数据的处理9

三、实验误差分析与处理10

四、实验报告的要求15

第2章 生物化学与分子生物学实验基本技能训练17

第一节 基本操作技能17

一、玻璃仪器的洗涤与干燥17

二、溶液的混匀18

三、过滤、加热与冷却19

第二节 基本器材与仪器的使用21

一、刻度吸管的使用21

二、可调微量移液器的使用22

三、容量瓶的使用23

四、电子天平的使用23

五、pH计的使用25

第3章 生物化学与分子生物学实验样品的制备27

第一节 样品制备的基本原则与策略27

一、生物样品制备的基本原则27

二、生物样品制备的基本策略28

第二节 常用实验样品的制备28

一、血液样品29

二、尿液样品29

三、组织样品30

四、微生物样品31

五、植物样品31

第三节 生物大分子的制备31

一、核酸的分离纯化31

二、蛋白质的分离纯化33

第二篇 生物化学与分子生物学实验技术的基本原理39

第4章 分光光度技术39

第一节 基本原理39

一、光的基本知识39

二、朗伯-比尔定律40

第二节 分光光度技术的应用41

一、定量分析41

二、定性分析42

三、纯度检测43

四、分光光度法的误差43

第三节 分光光度计的基本结构及使用43

一、分光光度计的基本构造44

二、常见分光光度计的使用44

三、分光光度计使用的注意事项46

第5章 电泳技术47

第一节 基本原理47

一、电泳的原理47

二、影响电泳速度的外界因素48

第二节 电泳分类48

一、按工作原理分类48

二、按分离目的分类49

三、按用法分类49

第三节 常用电泳技术49

一、纸电泳49

二、醋酸纤维素薄膜电泳50

三、琼脂糖凝胶电泳51

四、聚丙烯酰胺凝胶电泳51

五、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳53

六、等电聚焦电泳53

七、双向凝胶电泳54

八、免疫电泳56

九、毛细管电泳57

第四节 电泳装置的结构及使用58

一、电泳装置58

二、使用方法61

第6章 层析技术63

第一节 基本原理63

一、层析的基本概念63

二、层析的基本原理64

三、层析技术的分类66

第二节 吸附层析66

一、吸附层析的原理66

二、吸附层析的分类67

三、吸附剂和洗脱剂的选择68

第三节 分配层析69

一、分配层析的原理69

二、纸层析69

第四节 离子交换层析70

一、离子交换层析的原理70

二、离子交换剂的类型71

三、离子交换层析的应用71

四、离子交换树脂的处理72

第五节 凝胶层析72

一、凝胶层析的原理72

二、凝胶层析的实验技术73

三、凝胶层析的应用75

第六节 亲和层析76

一、亲和层析的原理76

二、亲和层析的基本过程76

三、亲和层析载体、配体的选择与偶联77

第7章 离心技术79

第一节 离心技术的基本原理79

一、离心力80

二、相对离心力80

三、沉降系数80

第二节 离心分离的常用方法81

一、沉淀离心法81

二、差速离心法81

三、密度梯度离心法82

第三节 离心机的分类及使用84

一、制备型离心机84

二、分析型离心机85

三、离心操作注意事项及其维护保养85

第8章 核酸分子杂交技术87

第一节 基本原理87

一、DNA的变性87

二、DNA的复性88

三、核酸分子杂交88

第二节 核酸探针及其标记89

一、核酸探针89

二、探针的标记90

第三节 常用核酸分子杂交技术93

一、固相杂交技术93

二、液相杂交技术95

三、核酸分子杂交实验条件的优化97

第三篇 基本型实验103

第9章 蛋白质、氨基酸实验103

第一节 蛋白质的定量测定103

实验1蛋白质的定量测定（微量凯氏定氮法）104

实验2蛋白质的定量测定（双缩脲法）108

实验3蛋白质的定量测定（Folin-酚试剂法）110

实验4蛋白质的定量测定（BCA法）112

实验5蛋白质的定量测定（考马斯亮蓝染色法）114

实验6蛋白质的定量测定（紫外吸收法）116

第二节 蛋白质相对分子量测定（SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳）118

第三节 血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳及其定量125

第四节 氨基酸的薄层层析129

第五节 氨基酸的纸层析132

第10章 酶学实验136

第一节 过氧化氢酶米氏常数的测定136

第二节 血清丙氨酸氨基转移酶活性测定（赖氏法）139

第三节 琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制142

第四节 乳酸脱氢酶同工酶琼脂糖电泳法测定144

第11章 糖类、脂类实验147

第一节 血糖的定量测定147

实验1血糖的定量测定（Folin-吴宪法）148

实验2血糖的定量测定（葡萄糖氧化酶法）151

实验3血糖的定量测定（己糖激酶法）153

第二节 乳酸的定性分析与定量测定155

实验1尿中乳酸含量的定性分析156

实验2血液中乳酸含量的定量测定157

第三节 血清甘油三酯的测定（乙酰丙酮显色法）159

第四节 血清总胆固醇的测定（胆固醇氧化酶法）162

第12章 核酸实验165

第一节 核酸的定量测定165

实验1 核酸的定量测定（定磷法）165

实验2 核酸的定量测定（紫外吸收法）168

实验3 DNA的定量测定（二苯胺法）169

实验4 RNA的定量测定（地衣酚法）171

第二节 核酸的琼脂糖凝胶电泳173

实验1 DNA的琼脂糖凝胶电泳173

实验2 RNA的甲醛变性凝胶电泳176

第三节 核酸的聚丙烯酰胺凝胶电泳179

第四节 DNA的聚合酶链式反应181

第四篇 综合设计型实验191

第13章 综合性实验191

第一节 血清清蛋白、γ-球蛋白的分离纯化与定量191

第二节 碱性磷酸酶的分离纯化、比活性测定与动力学分析201

实验1碱性磷酸酶的分离纯化和比活性测定201

实验2底物浓度对碱性磷酸酶活性的影响205

实验3 pH对碱性磷酸酶活性的影响208

实验4温度对碱性磷酸酶活性的影响210

第三节 肝糖原的提取、鉴定与定量212

实验1肝糖原的提取与鉴定212

实验2肝糖原定量测定214

第四节 血清脂蛋白的电泳分离与定量测定216

实验1血清脂蛋白的琼脂糖凝胶电泳218

实验2血清高密度脂蛋白-胆固醇的分离与定量测定（磷钨酸-镁沉淀法）221

第五节 质粒DNA的提取、定量与酶切鉴定224

实验1质粒DNA的小量提取（碱裂解法）225

实验2高纯质粒小量制备（试剂盒法，离心柱型）230

实验3质粒DNA的定量（紫外分光光度法）232

实验4质粒DNA的酶切鉴定233

第六节 基因组DNA的提取、定量与鉴定238

实验1细菌基因组DNA的提取、定量与鉴定238

实验2动物组织基因组DNA的提取、定量与鉴定241

第七节 总RNA的提取、定量与逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）244

实验1总RNA的提取与定量245

实验2逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）249

第八节 Southern杂交254

实验1基因组DNA样品的限制性酶切254

实验2酶切样品的琼脂糖凝胶电泳256

实验3 DNA的变性、转膜与固定258

实验4杂交与杂交后清洗260

实验5杂交结果的检测262

第九节 斑点或狭缝杂交264

第14章 设计性实验270

第一节 设计性实验的基本程序270

一、选题定题270

二、实验设计272

三、实验实施274

四、实验总结275

第二节 生物化学与分子生物学实验设计的基本思路275

一、蛋白质研究的实验设计275

二、酶学研究的实验设计279

三、核酸研究的实验设计282

四、糖类的实验设计287

五、脂类及维生素的实验设计289

第五篇 研究创新型实验293

第15章 分子克隆实验293

第一节 目的基因的分离与载体的选择294

实验1目的基因的分离294

实验2载体的选择297

第二节 目的基因与载体的限制性酶切及酶切产物的回收299

实验1目的基因与载体的限制性酶切299

实验2酶切产物的回收303

第三节 目的基因与载体的连接306

实验1酶切产物的克隆（T4 DNA连接酶法）307

实验2 PCR产物的TA克隆310

第四节 重组DNA的导入313

第五节 阳性重组体的筛选与鉴定316

实验1阳性重组体的筛选（a-互补法）317

实验2阳性重组体的鉴定（菌落PCR法）319

第六节 目的基因的表达及鉴定321

第七节 研究创新型实验设计：绿色荧光蛋白（GFP）的基因克隆与表达323

附录 生物化学与分子生物学实验试剂的配制与保存及常用数据表329

附录A 试剂的配制与保存329

一、化学试剂分级及注意事项329

（一）化学试剂纯度分级表329

（二）试剂配制的一般注意事项329

（三）易变质及需要特殊方法保存的试剂330

二、常用试剂及溶液的配制330

（一）常用清洗液的配制330

（二）常用试剂的配制331

（三）常用缓冲液的配制333

（四）电泳常用缓冲液的配制338

（五）常用储存液的配制339

三、细菌实验试剂的配制与保存340

（一）细菌培养基的配制340

（二）抗生素的配制342

（三）细菌的保存343

附录B 常用数据表344

一、常用蛋白质相对分子质量标准数据344

二、氨基酸的主要参数344

三、核酸、蛋白质换算数据345

四、常用核酸相对分子质量标准数据346

五、琼脂糖凝胶浓度与线形DNA的最佳分辨范围346

六、PAGE凝胶配方（核酸电泳用）346

七、SDS-PAGE的浓缩胶（5% Acrylamide）配方347

八、SDS-PAGE分离胶配方348

九、SDS-PAGE分离胶的浓度与最佳分离范围349

参考文献350