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第一章 毒理学实验基础1

第一节 毒理学实验的原则和局限性1

第二节 毒理学毒性评价试验的基本目的3

第三节 动物实验的职业道德4

第四节 实验动物的选择和管理4

一、实验动物物种的选择4

二、实验动物品系的选择6

三、对实验动物微生物和寄生虫控制的选择6

四、个体选择7

五、实验动物的管理8

第五节 受试物和样品的准备8

第六节 实验动物的准备和操作10

一、动物实验前的准备10

二、实验动物的抓取和保定11

三、实验动物的标示和识别12

四、实验动物随机分组13

第七节 实验动物染毒和处置13

一、实验动物染毒13

二、实验动物生物标本采集17

三、实验动物疼痛评估18

四、实验动物的麻醉19

五、实验动物安死术20

六、病理解剖和标本留取22

第八节 毒理学试验的统计学基础23

一、毒理学试验设计要点23

二、毒理学试验的统计学要点25

三、统计学意义、生物学意义和毒理学意义27

第九节 转基因动物模型29

一、转基因动物的培育原理与技术方法29

二、转基因动物模型在毒理学中的应用31

第二章 一般毒性试验36

第一节 急性毒性试验36

一、经口急性毒性试验36

二、经呼吸道静式吸入急性毒性试验39

三、经皮肤急性毒性试验40

第二节 局部毒性试验41

一、急性眼刺激试验41

二、阴道黏膜刺激试验44

第三节 亚慢性毒性实验46

一、亚慢性经口毒性试验46

二、亚慢性经皮毒性试验50

第四节 慢性毒性试验51

第三章 遗传毒性试验和致癌试验54

第一节 遗传毒性试验54

一、鼠伤寒沙门菌营养缺陷型回复突变试验54

二、哺乳动物细胞基因突变试验58

三、染色体畸变分析62

四、小鼠骨髓细胞微核试验65

第二节 致癌试验67

一、哺乳动物细胞体外恶性转化试验67

二、哺乳动物长期致癌试验69

第四章 分子毒理学实验72

第一节 生物大分子的分离与纯化72

一、组织与细胞核酸的分离与纯化72

二、组织与细胞蛋白质的分离与纯化75

第二节 生物大分子损伤的检测77

一、DNA链断裂检测78

二、DNA交联检测79

三、DNA加合物检测82

四、DNA氧化产物检测84

五、蛋白质氧化产物检测86

第三节 基因突变和多态性检测90

一、DNA序列分析90

二、聚合酶链反应-单链构象多态性分析92

三、聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析95

四、微卫星分析97

五、荧光原位杂交98

第四节 表观遗传效应检测100

一、DNA甲基化检测100

二、组蛋白修饰检测102

三、microRNA检测105

第五节 基因表达检测106

一、差异表达基因分析106

二、差异蛋白质组分析111

第五章 细胞毒理学实验114

第一节 体外细胞毒性试验的种类和选择依据114

第二节 细胞形态学研究方法116

一、普通显微镜观察方法116

二、电子显微镜观测技术118

第三节 细胞存活率测定121

一、台盼蓝染色法121

二、乳酸脱氢酶释放法122

三、中性红染料滞留试验122

四、碘化丙啶染色法123

第四节 细胞增殖测定124

一、细胞直接计数法124

二、3 H-TdR掺入法124

三、细胞周期分析125

第五节 细胞代谢活力测定125

一、MTT试验125

二、Alamar Blue还原法125

第六节 细胞凋亡的检测方法126

一、形态学观察方法126

二、生化特征检测方法128

第七节 细胞自噬的检测131

一、电子显微镜观察自噬体形成131

二、GFP-LC3融合蛋白示踪自噬体形成—荧光显微镜定量检测法132

三、蛋白印迹检测LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ133

第八节 流式细胞仪分析技术134

一、流式细胞仪的检测原理和应用134

二、细胞周期检测135

三、细胞凋亡检测136

第九节 免疫细胞化学法138

一、免疫细胞化学染色方法138

二、免疫荧光细胞化学法139

三、免疫酶细胞化学法140

四、亲和免疫细胞化学法141

第十节 激光共聚焦显微镜和荧光标记技术143

一、激光扫描共聚焦显微镜143

二、荧光标记技术145

三、细胞内钙离子测定146

第六章 血液毒理学研究方法148

第一节 红细胞毒理学检测148

一、网织红细胞计数148

二、红细胞渗透脆性试验149

三、高铁血红蛋白测定149

四、变性珠蛋白小体测定150

五、碳氧血红蛋白测定151

六、铁动力学试验152

第二节 白细胞和血小板毒理学检测152

一、白细胞墨汁吞噬试验152

二、血小板黏附试验153

第三节 凝血功能毒理学检测154

一、活化部分凝血活酶时间测定154

二、血浆凝血酶原时间测定155

三、血浆凝血酶时间测定156

第四节 骨髓毒理学检测157

一、骨髓细胞学检查157

二、外源性脾结节测定159

三、体内扩散盒琼脂培养技术159

四、骨髓微循环观察160

第七章 免疫毒理学研究方法161

第一节 免疫细胞和免疫功能检测方法161

一、固有免疫功能测定——NK细胞活性测定161

二、固有免疫功能测定——巨噬细胞吞噬功能测定162

三、体液免疫功能测定——ELISA法检测免疫球蛋白163

四、体液免疫功能测定——溶血空斑试验164

五、细胞免疫功能测定——淋巴细胞增殖试验166

六、细胞免疫功能测定——迟发型超敏反应167

七、免疫细胞表型分析——T淋巴细胞亚群测定168

第二节 超敏反应检测方法169

一、Ⅰ型超敏反应测定——豚鼠支气管激发试验169

二、Ⅳ型超敏反应测定——局部淋巴结试验170

第八章 生殖毒理学研究方法172

第一节 生殖毒性试验172

一、一代生殖毒性试验172

二、两代（多代）生殖毒性试验174

三、三段生殖毒性试验175

第二节 环境内分泌干扰物筛选与评价方法179

一、大鼠子宫增重试验179

二、雌激素受体结合试验180

三、雌激素受体转录激活试验182

四、雄激素受体转录激活试验183

五、甲状腺激素受体转录激活试验184

六、H295R类固醇合成试验186

七、非洲爪蟾变态试验187

第三节 精子动力学分析188

一、大鼠精子动力学分析188

二、小鼠精子动力学分析189

第四节 性激素水平分析191

一、血清、睾丸或卵巢组织匀浆液中促卵泡激素检测191

二、尿液中促卵泡激素检测192

三、尿液中人绒毛膜促性腺激素检测194

第九章 神经毒理学研究方法197

第一节 神经毒性评价方法197

一、迟发型神经毒性试验197

二、形态学方法198

三、生理学与生物化学方法200

四、分子生物学方法206

五、电生理实验方法209

第二节 神经行为功能评价方法211

一、FIOH测试组合211

二、WHO-NCTB测试组合211

三、NES方法211

第三节 行为发育毒性测试方法212

一、行为发育毒性测试组合212

二、行为发育毒性研究组合214

第十章 呼吸毒理学研究方法219

第一节 整体实验研究方法219

一、肺功能测定219

二、呼吸道液分泌功能测定——小鼠酚红排泄法222

三、在体BAL与BALF分析222

四、大鼠气道黏液中肺表面活性物质的测定224

第二节 离体试验法225

一、离体肺灌流与分析225

二、离体气管片实验法226

三、胎鼠肺细胞原代培养与上皮细胞纯化227

四、体外培养的肺巨噬细胞中LDH活性测定228

第十一章 肝脏毒理学研究方法230

第一节 肝损害的体内评价方法230

一、化学性肝损伤动物模型230

二、肝微粒体制备及蛋白质含量与相关酶活性测定231

三、肝脏排泄功能测定237

四、肝脏分泌功能测定240

五、肝纤维化测定242

第二节 肝损害的体外评价方法243

一、体外离体肝灌流与分析243

二、大鼠肝细胞原代培养试验方法245

三、肝细胞膜流动性检测247

四、肝细胞线粒体提取及线粒体活性测定249

五、肝细胞线粒体膜通透性转运孔检测251

六、肝细胞线粒体呼吸功能检测253

七、肝细胞线粒体能量代谢功能检测255

第十二章 肾脏毒理学研究方法258

第一节 体内实验258

一、尿液的一般生化指标258

二、肾脏血流动力学和血流量分析259

三、肾小球滤过率和肾脏清除率测定261

四、肾脏的微穿刺和微灌注技术与应用265

五、电子探针微分析法267

第二节 体外试验268

一、体外细胞培养与细胞毒性试验268

二、肾膜囊泡的分离与应用269

三、离体肾脏灌流269

第十三章 心血管毒理学研究方法271

第一节 心功能评价方法271

一、心电图271

二、心向量图271

三、心搏出量272

四、心阻抗血流图272

五、超声心动图272

六、磁共振技术272

第二节 心血管毒理学体外研究方法273

一、心肌细胞原代培养273

二、大鼠血管内皮细胞原代培养274

第三节 心血管毒理学体内研究方法275

第十四章 皮肤毒理学研究方法277

第一节 皮肤刺激性/腐蚀性试验277

一、皮肤刺激性/腐蚀性试验277

二、小鼠皮肤功能完整性试验281

第二节 皮肤致敏和光毒性试验282

一、皮肤致敏试验282

二、小鼠耳肿胀试验286

三、皮肤光毒性试验287

四、皮肤光变态反应试验289

五、体外3T3中性红摄取光毒性试验290

第三节 皮肤接触性荨麻疹试验292

一、非免疫接触性荨麻疹试验292

二、免疫接触性荨麻疹试验293

第四节 人体皮肤毒理学评价试验294

一、人体斑贴试验294

二、光斑贴试验296

三、人体激发斑贴试验297

四、人体皮肤试用试验298

第十五章 毒理学试验替代方法301

第一节 急性毒性试验替代方法301

一、经口急性毒性试验-固定剂量法302

二、经口急性毒性试验-急性毒性分级法305

三、经口急性毒性试验-上下法308

第二节 皮肤刺激/腐蚀性替代方法311

一、体外皮肤腐蚀—透皮电阻试验311

二、体外皮肤腐蚀—人类皮肤模型试验312

三、皮肤腐蚀的体外膜屏障试验方法313

第三节 皮肤吸收替代试验—皮肤吸收：体外方法314

第四节 皮肤致敏试验替代方法316

一、局部淋巴结试验—DA法316

二、局部淋巴结试验—BrdU-ELISA法317

第五节 眼刺激试验替代方法318

一、牛角膜混浊和通透性试验319

二、离体鸡眼试验321

第六节 发育毒性替代试验324

一、胚胎干细胞试验324

二、微团培养试验329

三、植入后全胚胎培养试验331

主要参考文献338