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第1章 发酵技术(Peter F.Stanbury)1

1　引言1

2　微生物生长1

3 发酵的应用4

3.1 微生物生物量4

3.2 微生物代谢物4

3.3 微生物酶7

3.4 转化过程7

3.5 重组产品7

4 发酵过程7

5 产物形成的基因改良10

5.1 诱变10

5.2 重组13

6 总结15

参考文献15

第2章 分子分析及扩增技术(Ralph Rapley)18

1 引言18

1.1 分子生物学研究中常用的酶18

2 核酸的提取和分离20

2.1 DNA 提取技术20

2.2 RNA 提取技术21

3 核酸电泳21

4 DNA 片段酶切图谱23

5 核酸印迹和杂交24

5.1 杂交和严谨性24

6 基因探针的制备25

6.1 DNA 基因探针的标记26

6.2 非放射性 DNA 标记27

6.3 DNA 末端标记27

6.4 DNA 的随机引物标记28

6.5 DNA 的切口平移标记29

7 多聚酶链式反应29

7.1 PCR 的构成和操作过程31

7.2 热稳定 DNA 聚合酶33

7.3 PCR 引物的设计33

7.4 PCR 扩增的模板34

7.5 PCR 的灵敏度35

7.6 PCR 技术的改良35

7.7 PCR 的应用36

8 其他扩增技术37

9 DNA 的核苷酸序列分析38

9.1 双脱氧核苷酸链终止子测序法40

9.2 直接 PCR 测序法40

9.3 循环测序法40

9.4 自动荧光 DNA 测序法41

9.5 Maxam 和 Gilbert 测序42

10 生物信息学与因特网43

参考文献44

第3章 重组 DNA 技术(Ralph Rapley)47

1 引言47

2 基因文库的构建47

2.1 基因组 DNA 分子的消化47

2.2 DNA 分子的连接48

2.3 制备基因文库应考虑的因素50

2.4 基因组 DNA 文库50

2.5 cDNA 文库51

2.6 接头和衔接体53

2.7 RNA 的浓缩方法54

2.8 消减杂交法54

2.9 克隆 PCR 产物54

3 克隆载体55

3.1 源于质粒的克隆载体56

3.1.1 质粒筛选系统57

3.1.2 pUC 质粒克隆载体59

3.2 以病毒为基础的克隆载体60

3.2.1 插入型和置换型克隆载体61

3.3 M13和以噬菌粒为基础的克隆载体63

3.3.1 克隆入单链噬菌体载体64

3.4 以黏粒为基础的克隆载体66

3.5 具有插入大片段能力的克隆载体67

3.6 酵母人工染色体克隆载体67

3.7 真核细胞中使用的载体67

4 基因探针与杂交69

4.1 克隆 DNA 探针69

4.2 RNA 基因探针69

5 基因文库的筛选70

5.1 菌落与噬菌斑杂交70

5.2 通过 PCR 筛选基因文库71

5.3 筛选表达 cDNA 文库71

5.4 杂交选择/扣留翻译72

6 基因克隆的应用73

6.1 克隆 DNA 的测序73

6.2 体外诱变73

6.3 寡核苷酸指导的诱变74

6.4 基于 PCR 的诱变74

7 外源基因的表达75

7.1 产生融合蛋白76

7.2 在哺乳动物细胞中表达78

7.3 噬菌体蛋白展示78

8 基因分析与基因表达79

8.1 鉴定和分析 mRNA79

8.2 逆转录 PCR80

8.3 原位基因分析81

8.4 转基因学和基因打靶82

9 微型阵列与 DNA 芯片82

10 整个基因组分析83

10.1 基因组物理图谱84

10.2 基因的发现和定位85

10.3 人类基因组作图计划87

参考文献87

第4章 外源 DNA 在细菌中的表达(Robert J.Slater D.Ross Williams)90

1 引言90

2 基因表达的调控92

2.1 原核生物92

2.2 真核生物94

3 真核基因在细菌中的表达96

3.1 内含子96

3.2 启动子97

3.3 核糖体结合位点98

3.4 外源 DNA 以融合蛋白的形式表达98

3.5 天然蛋白的表达101

4 外源基因表达的检测103

5 最大水平地表达外源 DNA103

5.1 大肠杆菌中表达的优化105

6 采用其他宿主菌107

7 展望108

8 推荐读物109

参考文献109

第5章 酵母克隆和生物技术(Brendan P.G.Curran Virginia C.Bugeja)113

1 引言113

2 酿酒酵母的基因操作113

2.1 将 DNA 引入酵母113

2.2 酵母选择性标志113

2.3 载体系统114

3 外源蛋白生成116

3.1 外源 DNA 的来源116

3.2 细胞中外源 mRNA 的水平116

3.3 蛋白的产量117

3.4 所需产物的特征118

4 用酵母分析基因组、基因和蛋白与蛋白的相互作用119

4.1 YAC 技术119

4.2 基因敲除122

4.3 新的报告系统125

5 未来的展望126

参考文献127

第6章 在哺乳动物细胞系中克隆基因(Edward J.Murray)130

1 引言130

2 DNA 转染方法131

2.1 磷酸钙共沉淀132

2.2 DEAE 葡聚糖132

2.3 电穿孔132

2.4 原生质体融合133

2.5 脂染133

2.6 Polybrene-DMSO 处理134

2.7 显微注射134

2.8 刮染134

3 基因表达的要求135

4 DNA 组分137

4.1 载体的使用137

4.2 质粒类载体138

4.3 病毒类载体138

4.4 腺病毒载体139

4.5 逆转录病毒载体139

4.6 痘病毒载体140

4.7 杆状病毒载体141

5 选择细胞系的一些设想142

6 瞬时表达与稳定表达143

6.1 通过宿主细胞缺陷互补筛选143

6.2 显性选择技术143

6.3 可扩增的选择系统145

参考文献145

第7章 植物生物技术(Michael G.K.Jones)148

1 引言148

2 应用分子生物学加快作物品种改良过程148

2.1 作物植物的分子图谱148

2.2 分子标记物149

2.3 分子标记物类型149

2.4 分子标记物的辅助选择150

2.5 分子标记物辅助选择举例151

2.6 分子诊断151

2.7 DNA 指纹图谱、变异鉴定152

2.8 DNA 微阵列152

2.9 生物信息学152

3 转基因技术153

3.1 农杆菌介导的转化153

3.2 选择标记和报告基因153

3.3 粒子轰击法153

4 转基因技术的应用154

5 抗除草剂的工程作物155

6 对病虫害的抗性工程156

6.1 昆虫抗性工程156

6.2 植物病毒抗性工程157

6.3 真菌致病菌抗性158

6.4 自然抗性基因工程159

6.5 真菌致病菌抗性工程161

6.6 细菌致病菌抗性工程161

6.7 线虫致病菌抗性工程162

7 人工雄性不育162

8 胁迫耐受性163

9 性状控制163

9.1 延长贮存期164

9.2 营养和技术性状164

9.2.1 蛋白164

9.2.2 植物油164

9.2.3 淀粉性状改良165

9.2.4 果糖166

9.3 代谢分配调节166

10 植物聚合物和生物可降解塑料的生产166

11 植物生物反应器、生物药物和营养品167

11.1 可食用植物疫苗167

11.2 利用植物生产抗体167

11.3 植物营养品167

12 植物生物技术在林业中的应用168

13 知识产权168

14 公众接受程度169

15 展望170

参考文献170

第8章 药学研究中的分子、结构和化学生物学(Tomi K.Sawyer)174

1 引言174

2 疾病和体内转基因模型的分子生物学174

3 基因组蛋白质靶位与重组治疗学176

4 结构生物学与合理化药物设计180

5 化学生物学与分子多样性184

6 基因治疗与 DNA/RNA 靶向治疗187

7 药物研究的发展前景188

8 小结189

参考文献189

第9章 遗传修饰食物(Rosa K.Pawsey)196

1 引言196

2 新食品生产与加工所需的法律依据196

3 食用农作物201

4 食用动物203

5 制造类食品的发展趋势204

6 消费者认可与市场压力206

参考文献208

第10章 遗传病的分子诊断(Elizabeth Green)210

1 引言210

2 基因突变的直接检测211

2.1 基因缺失、倍增和插入的检测211

2.2 扩展突变的检测212

2.3 点突变的检测215

2.3.1 等位基因特异的寡核苷酸杂交分析215

2.3.2 限制性酶切位点分析215

2.3.3 ARMS216

2.3.4 寡核苷酸连接试验216

2.3.5 荧光标记 DNA 测序分析218

3 用连锁性遗传标记进行间接诊断220

4 前景展望220

参考文献221

第11章 DNA 在法医学中的应用(Paul Debenham Peter D.Martin)222

1 引言222

2 多位点探针和单位点探针223

2.1 MLP/SLP 方法225

2.1.1 DNA 的提取和纯化225

2.1.2 定量226

2.1.3 DNA 的限制性核酸内切酶消化226

2.1.4 电泳分离226

2.1.5 杂交226

2.2 结果分析227

3 PCR 技术228

3.1 最初以 PCR 为基础的法医系统228

4 短串联重复序列229

4.1 方法229

4.1.1 DNA 的提取229

4.1.2 DNA 的定量230

4.1.3 DNA 的扩增231

4.1.4 产物分离231

5 数据库231

6 结果解释233

7 线粒体 DNA234

8 Y 染色体分析235

9 展望235

9.1 毛细管电泳235

9.2 DNA 芯片技术236

参考文献237

第12章 免疫接种和基因操作(Michael Mackett)239

1 引言239

2 目前的免疫接种策略240

2.1 灭活疫苗241

2.2 减毒活疫苗242

2.3 活疫苗与死疫苗的相对优缺点242

3 遗传工程在疫苗的鉴定、分析和生产过程中的作用243

3.1 具有疫苗潜力的抗原的鉴定和克隆243

3.1.1 DNA/寡核苷酸杂交244

3.1.2 杂交筛选和无细胞翻译244

3.1.3 表达克隆244

3.1.4 基因组测序245

3.2 疫苗抗原的分析246

3.2.1 B 细胞表位246

3.2.2 T 细胞表位247

3.3 亚单位疫苗的产生248

4 改进和研究新的减毒活疫苗250

4.1 对现有的减毒活疫苗进行改进250

4.1.1 新的假狂犬病毒疫苗250

4.1.2 改善霍乱弧菌的减毒作用251

4.1.3 增强稳定性——脊髓灰质炎病毒(Poliovirus)252

4.2 重组活载体252

4.2.1 重组牛痘病毒252

4.2.2 重组卡介苗253

4.2.3 减毒沙门菌作为活菌苗254

4.2.4 脊髓灰质炎病毒的嵌合体254

4.2.5 交叉接种、“活/死”疫苗254

4.2.6 其他病毒载体255

4.2.7 重组大肠杆菌255

5 构建疫苗的其他方法255

5.1 DNA 疫苗(遗传免疫)255

5.1.1 优化反应256

5.1.2 RNA 免疫257

5.2 肽苗257

5.3 抗独特型258

5.4 增强免疫原性和改进免疫反应259

5.4.1 佐剂、蛋白载体、运载工具259

5.4.2 蛋白载体259

5.4.3 黏膜免疫260

5.4.4 细胞因子调节260

5.4.5 抗原靶向调节260

5.4.6 信号调节261

6 摘要和结论261

7 推荐的阅读材料和信息来源262

参考文献264

第13章 转基因(Linda J.Mullins John J.Mullins)268

1 引言268

2 通过显微注射制备转基因动物268

2.1 转基因小鼠268

2.2 转基因大鼠270

2.3 动物的选择270

2.4 显微注射技术在其他动物上的应用271

2.5 动物克隆271

3 胚胎干细胞技术、同源重组和转基因271

4 总论274

4.1 表达载体274

4.2 异位表达274

5 转基因实验的设计275

5.1 基因表达透视275

5.2 基因功能的减弱275

5.3 细胞剔除276

5.4 条件基因修饰276

5.4.1 使用 Cre-lox 系统的可诱导基因打靶276

5.4.2 四环素/三苯氧胺278

6 商业应用278

6.1 转基因动物生物制药278

6.2 异种移植279

6.3 毒理学应用279

6.4 “永生”鼠280

7 展望280

参考文献280

第14章 蛋白质工程(John R.Adair)286

1 引言286

1.1 蛋白质结构286

2 工具287

2.1 序列鉴定287

2.2 结构测定与模建287

2.3 序列修饰288

2.3.1 定点突变方法288

2.3.1.1 非 PCR 方法288

2.3.1.2 PCR 方法289

2.4 分子进化292

2.5 从头序列设计292

2.6 表达293

2.7 分析294

3 应用294

3.1 点突变295

3.1.1 Betaseron/Betaferon(干扰素β-1b)295

3.1.2 Humalog(Lispro Insulin)295

3.1.3 新疫苗佐剂295

3.2 结构域改组(连接、交换和删除)296

3.2.1 连接域296

3.2.1.1 细胞靶向区域融合296

3.2.1.2 细胞因子融合296

3.2.1.3 稳定二聚体蛋白的融合297

3.2.2 交换蛋白质结构域297

3.2.2.1 鼠和人的嵌合体抗体297

3.2.2.2 多聚乙酰合成酶298

3.2.3 缺失结构域299

3.3 全蛋白的重组299

3.4 蛋白质-配体相互作用299

3.4.1 酶修饰299

3.4.2 激素拮抗剂299

3.4.3 结合特异性替换300

3.5 关于从头设计301

4 总结与展望301

参考文献301

第15章 生物信息学(Peter M.Woollard)306

1 引言306

2 数据库308

2.1 序列数据库308

2.1.1 核酸序列数据库310

2.1.2 蛋白质序列数据库311

2.1.3 蛋白质家族和模体数据库312

2.2 基因组数据库312

2.3 酶数据库313

2.4 文献数据库314

2.4.1 Medline314

2.4.2 BIDS Embase314

2.4.3 BIDS ISI314

3 序列分析314

3.1 序列数据库搜索314

3.1.1 关键词搜索315

3.1.2 数据库搜索316

3.2 两两序列比较、联配和多重序列比较、联配317

3.2.1 两两比较317

3.2.2 多重序列联配318

3.2.3 改进联配320

3.2.4 谱型(profile)搜索320

3.3 其他的核酸序列分析321

3.3.1 基因识别321

3.3.2 限制性作图321

3.3.3 单核苷酸多肽性321

4 蛋白质结构321

5 作图322

5.1 引言322

5.2 连接分析322

5.3 物理作图322

5.4 辐射杂交322

5.5 引物设计323

6 生物信息学站点和中心323

6.1 局域生物信息学服务323

6.2 国家的 EMBnet 节点323

6.3 专门的站点324

7 结论和未来的展望324

参考文献324

第16章 生物催化剂的固定化(Gordon F.Bickerstaff)327

1 引言327

2 生物催化剂327

2.1 酶327

2.1.1 专一性328

2.1.2 催化活力329

2.2 核糖酶329

2.3 抗体酶330

2.4 多酶复合体331

2.4.1 丙酮酸盐脱氢酶复合物331

2.4.2 蛋白酶体331

2.4.3 纤维酶复合体331

2.4.4 多酶复合体和固定化技术332

2.5 细胞332

2.5.1 动物细胞333

2.5.2 植物细胞333

2.5.3 微生物(细菌、酵母和纤维状真菌)334

2.6 生物催化剂的选择334

3 固定化335

3.1 固定化载体的选择335

3.1.1 下一代固定化载体336

3.2 固定化过程的选择337

3.2.1 吸附法337

3.2.2 共价结合338

3.2.3 包埋法340

3.2.4 微囊法341

3.2.5 交联法341

4 固定化生物催化剂的性质342

4.1 稳定性342

4.2 催化活性343

5 应用344

参考文献345

第17章 下游过程——蛋白质提取和纯化(Mike D.Scawen P.M.Hammond)347

1 引言347

2 细胞破碎348

2.1 酶法破碎细胞348

2.2 化学法破碎细胞348

2.2.1 碱处理348

2.2.2 表面活性剂349

2.3 物理法破碎细胞349

2.3.1 渗透压冲击349

2.3.2 球磨法349

2.3.3 固体剪切349

2.3.4 液体剪切349

3 初级纯化350

3.1 细胞碎片去除350

3.2 分批离心350

3.3 连续流动离心350

3.4 筐式离心机351

3.5 膜过滤351

4 双水相萃取352

5 沉淀353

5.1 硫酸铵353

5.2 有机溶剂沉淀353

5.3 高分子聚合物353

5.4 热沉淀353

6 色谱353

6.1 放大及质量管理354

6.2 方法选择355

6.3 介质选择356

6.4 凝胶过滤357

6.5 离子交换色谱358

6.6 亲和色谱359

6.7 疏水色谱361

6.8 高效液相色谱技术361

6.9 灌注色谱362

6.10 膨胀床吸附363

6.11 膜色谱363

6.12 柱填充介质的维护364

6.13 大规模色谱设备364

6.14 控制和自控365

7 超滤365

8 为纯化过程而进行的蛋白质设计366

8.1 包涵体366

8.2 亲和尾367

9 未来的趋势369

参考文献369

第18章 单克隆抗体(Christopher J.Dean)372

1 引言372

2 抗体结构372

3 用体细胞融合技术制备杂交瘤373

3.1 技术原理373

3.2 骨髓瘤细胞系的选择373

3.3 制备免疫 B 细胞的宿主动物的选择374

3.4 免疫原和免疫途径375

3.5 融合用骨髓瘤细胞系和宿主免疫淋巴细胞的制备376

3.6 体细胞融合法制备杂交瘤376

3.7 杂交瘤培养上清的筛选376

3.8 杂交瘤的克隆377

3.9 单克隆抗体的大量生产、分离和纯化378

3.9.1 大量生产378

3.9.2 分离和纯化378

4 用于研究大分子结构和功能特性的大鼠单抗制备实例379

4.1 HIV I gp120379

4.2 抗生长因子受体单抗380

4.3 应用于临床的单克隆抗体381

5 用基因重组技术生产单克隆抗体381

5.1 免疫球蛋白可变区基因的分离及在噬菌体表面的表达381

5.1.1 轻、重链可变区 mRNA 的分离和 cDNA 的制备382

5.1.2 抗体 VH 和 VLcDNA 的 PCR 扩增383

5.1.3 单链抗体基因的构建383

5.1.4 将单链抗体基因插入噬粒载体383

5.1.5 单链抗体在噬菌体表面的表达383

5.1.6 噬菌体抗体库的筛选384

5.1.7 可溶性单链抗体的制备384

5.1.8 含可溶性单链抗体上清的筛选384

6 单克隆抗体在生物医学研究中的应用384

7 单克隆抗体在疾病的诊断和治疗中的应用385

参考文献386

第19章 生物传感器(Martin F.Chaplin)389

1 引言389

2 生物反应392

3 理论393

4 电化学方法394

4.1 安培型的生物传感器395

4.2 电位型生物传感器399

4.3 电导型生物传感器402

5 量热型生物传感器403

6 压电传感器405

7 光学型生物传感器406

7.1 消隐波生物传感器407

7.2 表面等离子体共振408

8 细胞传感器409

9 免疫传感器411

10 结论411

参考文献411

索引413