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第一章 生物医学试验方法策略1

第一节 研究问题的提出和研究方法的确立1

一、研究领域的发展1

二、问题的提出3

三、提出问题的假说或理论4

四、研究方向的界限5

五、研究内容的界定6

第二节 实验方法学的对应7

一、实验对象的选择7

二、实验对照的考虑8

三、技术方法的选用9

四、技术路线的确立10

五、实验内容与处理因素的相应性11

第三节 实验内容的合理与完善12

一、时间和空间的相关性12

二、实验的可重复性12

三、体外实验与体内实验的一致性12

四、生命组学的应用13

五、实验结果的连贯性13

六、实验的补充（或替补与完善）13

第四节 实验结果的分析与讨论13

一、确立实验结果内涵的不同性或差异13

二、不同性或差异性对于生物医学研究的局限14

三、与前人（或他人）研究的连续或发展14

四、回答所提出的问题的真实性14

五、对假说（或理论）成立的解答或判定14

第五节 试验资料的整理与论文发表15

一、明确影响因子在相应刊物的格式要求15

二、按相应刊物格式要求进行文章写作15

三、参考文献的阅读和引用，强调最新文献的引用15

四、依据实验结果讨论所提出的问题，回答其真实性17

五、依托和结合文献提供的领域发展，解答或判定假说（或理论）的成立17

第二章 实验室规则及安全防护18

第一节 实验室规则18

第二节 实验室安全防护18

一、实验室安全制度18

二、生物安全管理19

三、实验动物的安全管理20

四、化学药品的安全管理21

五、实验室“三废”处理22

第三章 基因组学常用实验技术23

第一节 核酸分离纯化23

一、基因组DNA的提取制备23

二、总RNA的提取制备25

三、质粒DNA的提取制备27

四、琼脂糖凝胶电泳29

五、聚合酶链式反应技术31

六、反转录PCR38

七、荧光定量PCR技术40

八、限制性内切酶46

九、凝胶中DNA片段的纯化回收51

第二节 分子杂交技术52

一、核酸分子探针的种类53

二、探针的标记物54

三、探针的标记方法55

四、标记探针的检测方法63

五、固相核酸杂交方法68

第三节 DNA序列分析技术80

一、DNA测序原理80

二、DNA测序的常用技术81

三、DNA测序策略81

四、全自动激光荧光DNA测序83

第四节 DNA芯片的使用86

一、DNA芯片的概述86

二、DNA芯片的应用86

三、DNA芯片的制作88

四、实验步骤89

五、注意事项90

第五节 细菌培养技术91

一、原理91

二、仪器、材料与试剂91

三、实验步骤92

四、注意事项92

第六节 感受态细胞制备92

一、原理92

二、实验材料准备93

三、实验步骤93

四、注意事项94

第七节 DNA体外重组技术94

一、原理94

二、DNA体外重组载体的种类和选择95

三、基因工程中常用的工具酶97

四、实验方法100

第八节 外源基因在原核生物中的表达103

一、实验原理103

二、实验步骤104

三、注意事项105

第九节 外源基因在真核细胞中的表达105

一、磷酸钙共沉淀106

二、电穿孔法106

三、阳离子脂质体试剂108

第十节 反义RNA109

一、反义RNA的原理109

二、反义RNA的应用110

三、反义RNA的实验步骤110

四、注意事项111

第十一节 RNA干扰111

一、RNA干扰的原理111

二、RNA干扰的应用113

三、RNA干扰的实验步骤113

四、注意事项115

第十二节 基因敲除115

一、基因敲除的原理115

二、动物基因敲除的步骤116

三、动物基因敲除的应用117

第十三节 转基因动物118

一、转基因动物的原理118

二、转基因动物的步骤119

三、转基因动物的主要方法119

四、转基因动物的应用120

附：肺结核杆菌rpoB基因DNA的扩增及测序分析实例122

第四章 蛋白质分离鉴定相关技术129

第一节 根据分子量大小不同进行分离纯化蛋白质129

一、凝胶过滤层析129

二、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳131

第二节 根据蛋白质带点性不同进行分离纯化134

一、离子交换层析法的原理134

二、离子交换剂及平衡缓冲剂的选择原则134

三、离子交换柱的装柱与平衡方法135

四、待纯化样品的准备和加样方法135

五、洗脱分离过程135

六、目标蛋白峰与杂峰的分离策略135

七、离子交换剂的处理和保存135

八、离子交换层析操作注意事项136

第三节 根据蛋白质的疏水性不同进行分离纯化136

一、疏水作用层析的基本原理136

二、层析介质的选择137

三、对样品的要求137

四、常用的洗脱方式137

五、层析介质的清洗与再生注意事项137

六、影响疏水性吸附的主要因素138

第四节 根据蛋白质的极性差异进行分离纯化138

一、反相层析的基本原理138

二、反相层析的应用特点139

三、反相层析的操作要点139

四、反相层析应用的注意事项140

第五节 根据蛋白质的配体特异性进行分离纯化140

一、亲和层析的基本原理140

二、亲和层析的基质与配基的选择141

三、亲和层析的基本实验步骤141

四、亲和层析的操作注意事项142

第六节 根据蛋白质的等电点差异进行分离纯化142

一、等电聚焦电泳的实验原理142

二、等电聚焦电泳所用的仪器和试剂143

三、等电聚焦电泳实验全流程简介143

第七节 用高效液相色谱方法进行蛋白质的分离纯化145

一、高效液相色谱法的基本原理145

二、高效液相色谱仪的组成146

三、HPLC在蛋白质分离中的应用及操作规程146

四、注意事项148

第八节 蛋白质的浓缩方法149

一、离子交换吸附法150

二、沉淀法150

三、超滤法152

四、冷冻干燥法153

五、吸收法154

第九节 蛋白质浓度定量方法154

一、Lowry法154

二、紫外吸收法测定蛋白质含量156

三、考马斯亮蓝G-250染色法157

四、BCA法158

第十节 蛋白质分子量测定方法159

一、不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳159

二、凝胶过滤层析法162

第十一节 混合蛋白中特定蛋白质的含量的测定方法165

一、酶联免疫吸附技术165

二、蛋白质印迹167

第十三节 用于蛋白质定性和定量的质谱方法169

一、电喷雾离子化质谱（ESI-MS）169

二、基质辅助激光解析电离飞行时间质谱171

三、高效液相色谱／双向电泳与基质辅助激光解析电离飞行时间质谱联用172

附：蛋白质定性、定量分析应用实例174

第五章 代谢组学179

一、代谢组学简介179

二、代谢组学的研究方法181

三、代谢组学在医学领域的应用193

附：代谢组学应用实例196

第六章 细胞学相关实验技术208

第一节 细胞培养基本知识208

一、体外培养细胞的种类208

二、体外培养细胞的特征209

三、培养细胞所需的条件与环境210

四、细胞培养室的设置212

五、细胞培养室的设备214

六、细胞培养用品的清洗和消毒灭菌216

第二节 细胞培养的基本技术221

一、基本操作技术和要求221

二、原代培养224

三、传代培养和细胞系的维持225

四、细胞冻存与复苏227

第三节 细胞形态观察与检测229

一、活细胞观察法229

二、细胞固定染色法233

三、电子显微镜观察法235

第四节 细胞遗传学的检测方法249

一、染色体结构显示与检测249

二、染色体基因定位251

第五节 细胞生物行为研究方法253

一、细胞活力检测方法253

二、细胞生长曲线257

三、细胞凋亡的检测方法258

四、克隆（集落）形成试验265

五、细胞迁移运动与侵袭能力实验266

六、细胞黏附实验268

七、膜片钳术269

第六节 细胞及细胞器分离技术271

一、采用离心技术分离淋巴细胞272

二、流式细胞分选技术272

三、有限稀释法273

四、平皿克隆分离法274

五、软琼脂克隆分离法274

六、单细胞显微克隆275

七、细胞器分离技术276

八、应用实例——肿瘤细胞中SP细胞流式分选281

第七节 细胞内化学成分的测定283

一、细胞内钙离子浓度测定283

二、细胞内药物浓度测定285

附：细胞模型应用实例287

第七章 免疫学实验技术292

第一节 概论292

一、抗原抗体反应的原理292

二、抗原抗体反应的特点292

三、抗原抗体反应的类型293

第二节 沉淀反应293

一、环状沉淀反应294

二、单向琼脂扩散294

三、双向琼脂扩散296

四、火箭电泳297

五、对流免疫电泳298

六、免疫电泳299

第三节 凝集反应300

一、直接凝集反应300

二、间接凝集反应301

第四节 补体参与反应304

一、补体结合实验304

二、血清总补体活性测定（CH50单位测定）309

三、用于检测未知抗体的间接法310

四、化学发光免疫分析技术312

五、免疫胶体金标记技术314

六、生物素—亲和素技术316

第五节 免疫细胞的分离与纯化318

一、白细胞的分离与纯化318

二、外周血的单个核细胞分离319

三、外周血单核细胞分离322

四、淋巴细胞的纯化与亚群分离323

五、流式细胞术的免疫分析（详见第六章 ）330

六、应用实例——吸附分离法（贴壁法）分离外周血单核细胞332

第六节 淋巴细胞的功能检测333

一、T淋巴细胞功能检测333

二、B淋巴细胞功能检测337

第七节 NK细胞活性检测342

一、乳酸脱氢酶释放法342

二、应用实例——YAC-1细胞株作为靶细胞测定人NK细胞活性343

第八节 吞噬细胞功能检测344

一、中性粒细胞吞噬功能测定345

二、人巨噬细胞吞噬功能检测346

三、小鼠巨噬细胞吞噬功能测定347

第九节 抗体的制备技术348

多克隆抗体的制备及鉴定348

附：直接免疫荧光法测抗原实例353

第八章 系统生物学简介356

一、系统生物学定义356

二、系统生物学的研究原理及内容357

三、系统生物学的研究方法358

四、系统生物学在医学领域研究思路举例368