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1 概 论1

1.1 基因疫苗发展概况1

1.2 基因疫苗的特点4

1.2.1 抗原性强4

1.2.2 保护时间长5

1.2.3 基因疫苗改造方便5

1.2.4 制备和储运方便6

2.1 天然免疫机制7

2 基因疫苗工作原理7

2.2 基因疫苗经肌肉组织免疫的抗原呈递8

2.3 基因疫苗经黏膜和皮肤组织免疫的抗原呈递10

2.3.1 直接免疫11

2.3.2 用重组减毒胞内菌系统12

2.3.2.1 胞内菌的胞内定位及其对基因疫苗的呈送12

2.3.2.2 携带基因疫苗重组减毒沙门氏菌诱发机体免疫应答的机制13

3 基因疫苗抗原基因的筛选与克隆14

3.1 疾病有关基因疫苗的候选基因筛选14

3.1.1.1 细菌病亚单位疫苗的编码基因作为基因疫苗候选基因15

3.1.1.2 病毒病亚单位疫苗编码基因作为基因疫苗的候选基因15

3.1.1 将亚单位疫苗的编码基因作为候选基因15

3.1.1.3 寄生虫基因疫苗的候选基因16

3.1.2 从病原体中筛选保护性抗原基因17

3.1.2.1 表达文库筛选候选基因17

3.1.2.2 免疫筛选法18

3.1.2.3 化学分解法18

3.1.3 定位克隆18

3.1.3.1 家系连锁分析法19

3.1.3.2 等位基因共享法20

3.1.3.3 群体相关分析法20

3.1.4 mRNA差异显示技术筛选候选基因21

3.1.3.4 cDNA筛选21

3.1.4.1 酶降解减数cDNA文库法23

3.1.4.2 减数cDNA文库筛选法23

3.1.4.3 PCR放大差异法24

3.1.4.4 差异反转录PCR法和差异消减显示法25

3.1.4.5 基因组错配扫描法25

3.1.4.6 限制性标记cDNA扫描26

3.1.4.7 消减杂交26

3.1.4.8 mRNA差异显示技术改进28

3.2.1.1 多肽N端序列指导PCR引物合成法30

3.2.1 克隆已知多肽的基因30

3.2 候选抗原基因克隆30

3.2.1.2 特异性抗体筛选表达文库法31

3.2.1.3 人工合成候选基因31

3.2.2 克隆已知序列基因家族新成员31

3.2.2.1 同源探针筛选法31

3.2.2.2 PCR放大建库法32

3.2.3 功能性筛选32

3.2.4.1 质粒特性33

3.2.4.2 质粒载体必须具备的条件33

3.2.4 常用的克隆载体33

3.2.4.3 常用的克隆质粒35

4 基因疫苗的构建37

4.1 构建基因疫苗的载体37

4.1.1 真核表达载体的结构特点37

4.1.1.1 增强子－启动子元件37

4.1.1.2 载体的选择标记38

4.1.1.3 哺乳动物细胞和大肠杆菌的复制起始点39

4.1.1.4 转录终止信号和多聚腺苷酸化信号39

4.1.3.2 pBudCE440

4.1.3.1 pcDNA3.1/Zeo(+/-)40

4.1.3 常用于构建基因疫苗的载体40

4.1.2 影响外源基因表达的因素40

4.1.3.3 pRc/CMV241

4.1.3.4 pRc/RSV41

4.2 基因疫苗构建方法41

4.2.1 抗原基因和载体的制备41

4.2.2 抗原基因和载体的连接43

4.2.2.1 连接方式43

4.2.2.2 连接反应条件44

4.2.3.1 氯化钙共沉淀法45

4.2.3 重组质粒转化受体菌45

4.2.3.2 电穿孔法46

4.2.4 重组质粒的筛选与鉴定46

4.2.4.1 插入片段长度鉴定47

4.2.4.2 插入片段方向性鉴定47

4.2.4.3 DNA序列测定47

4.3 重组质粒在真核细胞中表达与检测49

4.3.1 重组质粒导入真核细胞的方法49

4.3.1.1 脂质体介导的基因转移49

4.3.1.3 电穿孔法50

4.3.1.2 磷酸钙共沉淀法50

4.3.2 抗原基因在真核细胞中表达的检测51

4.3.2.1 蛋白水平的检测51

4.3.2.2 核酸水平的检测53

5 基因疫苗制备55

5.1 基因疫苗小量制备55

5.1.1 受体菌筛选55

5.2.1 基因疫苗中量制备56

5.2 基因疫苗中量制备56

5.1.3 基因疫苗小量制备56

5.1.2 培养条件优化56

5.2.2 基因疫苗纯化57

5.2.2.1 细菌的裂解和基因疫苗初步提取57

5.2.2.2 质粒纯化58

5.2.2.3 重组质粒浓缩60

5.2.3 基因疫苗质量监控61

5.2.3.1 重组质粒浓度测定61

5.2.3.2 纯度测定61

5.2.3.5 内毒素63

5.2.3.4 限制性内切核酸酶图谱分析63

5.2.3.3 分子质量鉴定63

5.3 基因疫苗大量制备64

5.3.1 中试规模64

5.3.2 工程菌的发酵条件64

5.3.2.1 发酵监测参数65

5.3.2.2 发酵方式65

5.3.2.3 基质浓度对发酵的影响66

5.3.2.4 温度对发酵的影响66

5.3.2.5 pH对发酵的影响68

5.3.2.6 溶解氧浓度对发酵的影响69

5.3.2.7 二氧化碳对发酵的影响71

5.3.2.8 泡沫控制71

5.3.3 基因疫苗大量纯化工艺73

5.3.3.1 细胞破碎73

5.3.3.2 重组质粒粗提73

5.3.3.3 粗提物纯化74

5.3.4 大量制备的质量控制80

5.3.4.1 原料质量控制81

5.3.4.3 纯化过程质量控制82

5.3.4.4 成品质量控制82

5.3.4.2 培养过程的质量控制82

6 基因疫苗免疫方法84

6.1 基因疫苗免疫方法84

6.1.1 肌肉注射法84

6.1.1.1 肌肉组织预处理85

6.1.1.2 肌肉注射操作例子85

6.1.1.3 影响重组质粒进入肌细胞的因素86

6.1.2 基因枪导入法86

6.1.2.1 皮下基因免疫的组织学基础86

6.1.2.3 重组质粒包被方法87

6.1.2.2 基因枪工作原理87

6.1.3 黏膜表面涂布法88

6.1.4 静脉注射法88

6.1.5 腹腔注射法88

6.1.6 不同免疫途径的免疫效果比较89

6.2 免疫剂量和加强免疫89

6.2.1 免疫剂量89

6.2.2 加强免疫90

7 基因疫苗免疫效果检测91

7.1 体液免疫检测91

7.1.1.2 竞争法测抗原或抗体92

7.1.1 酶联免疫吸附试验92

7.1.1.1 夹心ELISA92

7.1.1.3 间接法测抗体93

7.1.2 生物素－抗生物素蛋白系统93

7.1.2.1 标记抗生物素蛋白－生物素检测法93

7.1.2.2 桥联抗生物素蛋白－生物素检测法94

7.1.2.3 抗生物素蛋白－生物素化酶复合物检测法94

7.1.3 生物素－链霉抗生物素蛋白系统94

7.1.5 斑点－ELISA95

7.2 细胞免疫检测95

7.1.4 酶联免疫荧光测量法95

7.2.1 T细胞功能测定96

7.2.1.1 T细胞增殖反应测定96

7.2.1.2 细胞毒T细胞（CTL）功能测定98

7.2.2 NK细胞活性测定99

7.2.2.1 形态学方法99

7.2.2.2 51Cr释放法100

7.2.3 细胞免疫反应的间接测定方法100

7.2.3.1 免疫方法测定细胞因子含量101

7.2.3.2 生物学方法测定细胞因子含量101

7.2.3.3 细胞因子mRNA定量测定102

8.1 接种方法对免疫效果的影响103

8 影响基因疫苗免疫效果的因素103

8.1.1 肌肉内注射104

8.1.1.1 肌细胞摄取基因疫苗的假说104

8.1.1.2 肌细胞持续表达基因疫苗105

8.1.1.3 影响肌肉注射基因疫苗效果的因素106

8.1.2 皮内注射107

8.1.3 基因枪法108

8.2.1 载体中CpG元件的免疫刺激作用109

8.1.4“无针”注射法109

8.2 载体特征对基因疫苗免疫效果的影响109

8.2.1.1 CpG元件的免疫刺激作用110

8.2.1.2 ISS对基因疫苗的免疫刺激作用113

8.2.2 启动子对抗原基因转录水平的影响115

8.2.3 载体大小对基因免疫的影响116

8.2.4 多抗原表达116

8.3.1 细胞因子的佐剂效应117

8.3.1.1 免疫佐剂效应的表现117

8.3 免疫佐剂和辅佐分子的作用117

8.3.1.2 细胞因子的作用机制119

8.3.2 趋化因子的佐剂效应121

8.3.3 共刺激分子的佐剂效应122

8.3.4 脂质体介导的基因免疫124

8.3.5 微生物蛋白的佐剂效应125

8.4 多种类型疫苗联合应用125

8.5 机体对基因疫苗的影响126

9.1 局部反应和全身毒性评定127

9 基因疫苗的安全性127

9.1.1 诱导机体产生特异性免疫耐受128

9.1.2 自身免疫反应128

9.2 遗传毒性评定128

9.3 生殖毒性评定129

9.4 肿瘤发生评定129

9.4.1 整合到基因组中的可能性129

9.4.2 抗原基因选择130

9.5 基因免疫效果评定130

9.6 佐剂和免疫苗设备评定130

10.1.1 传统疫苗131

10.1.2 基因疫苗131

10.1 布氏杆菌基因疫苗131

10 细菌病基因疫苗131

10.2 结核杆菌基因疫苗132

10.2.1 传统疫苗132

10.2.2 基因疫苗133

10.3 肺炎球菌基因疫苗134

10.3.1 传统疫苗134

10.3.2 基因疫苗135

10.4 肺炎枝原体基因疫苗135

10.4.2 基因疫苗136

10.4.1 传统疫苗136

10.5 沙眼衣原体基因疫苗137

10.5.1 传统疫苗137

10.5.2 基因疫苗137

10.6 破伤风杆菌基因疫苗138

10.6.1 传统疫苗138

10.6.2 基因疫苗138

10.7 蜱媒螺旋体病基因疫苗139

10.7.1 传统疫苗139

10.7.2 基因疫苗140

11.1.2 HBV基因疫苗141

11.1.1 HBV传统疫苗141

11 病毒病基因疫苗141

11.1 乙型肝炎基因疫苗141

11.1.2.1 抗原基因142

11.1.2.2 基因疫苗现状142

11.2 丙型肝炎病毒基因疫苗144

11.2.1 HCV核心区基因疫苗的构建144

11.2.2 HCV包膜区基因疫苗的构建145

11.2.3 C+E区基因疫苗的构建145

11.2.4 HCV非结构区（NS区）基因疫苗的构建146

11.3 艾滋病基因疫苗146

11.3.1.1 减毒活疫苗和灭活疫苗147

11.3.1 传统的艾滋病疫苗147

11.3.1.2 亚单位蛋白疫苗148

11.3.2 基因疫苗148

11.4 流感病毒基因疫苗151

11.4.1 H1和H7基因疫苗152

11.4.2 HA基因疫苗153

11.4.3 NP基因疫苗153

11.5 狂犬病基因疫苗154

11.6.1.1 灭活疫苗155

11.6.1 常规疫苗155

11.6 登革病毒基因疫苗155

11.6.1.2 活疫苗156

11.6.1.3 亚单位疫苗157

11.6.2 基因疫苗158

11.7 其他病毒基因疫苗158

11.7.1 汉坦病毒基因疫苗158

11.7.2 牛传染性鼻气管炎病毒159

11.7.3 单纯疱疹基因疫苗159

12 寄生虫病基因疫苗160

12.1.1 传统疫苗161

12.1 疟疾基因疫苗161

12.1.2 基因疫苗162

12.1.2.1 孢子体表面蛋白2基因疫苗162

12.1.2.2 环子孢子蛋白基因疫苗162

12.1.2.3 疟原虫蛋白17基因疫苗164

12.1.2.4 HEP17/CSP联合基因疫苗165

12.1.2.5 裂殖子主要表面蛋白基因疫苗165

12.1.2.6 有性期抗原基因疫苗165

12.2.1.3 抗独特型抗体疫苗166

12.2.1.2 研制混合多价疫苗166

12.2.1 传统疫苗166

12.2.1.1 构建基因工程菌株和人工载体疫苗166

12.2 日本血吸虫基因疫苗166

12.2.1.4 血吸虫病合成多肽疫苗167

12.2.1.5 抗卵免疫研究167

12.2.2 基因疫苗167

12.2.2.1 虫卵蛋白基因疫苗167

12.2.2.2 虫体蛋白基因疫苗168

12.3 利什曼病基因疫苗169

12.3.1 传统疫苗170

12.3.2 基因疫苗171

12.4 猪带绦虫病基因疫苗171

12.4.1 传统疫苗171

12.4.2 基因疫苗172

13 肿瘤基因疫苗173

13.1 肿瘤抗原及相关抗原173

13.2 传统肿瘤疫苗175

13.2.1 过继免疫治疗175

13.2.2 肿瘤细胞疫苗175

13.2.3.1 导入细胞因子基因176

13.2.3 基因修饰的瘤苗176

13.2.3.2 导入癌基因或肿瘤相关抗原基因177

13.2.3.3 导入共刺激分子177

13.2.3.4 导入MHC基因178

13.2.4 蛋白／肽疫苗178

13.2.4.1 蛋白疫苗178

13.2.4.2 肽疫苗181

13.2.5 荷载肿瘤细胞抗原肽的树突细胞肿瘤疫苗181

13.3 肿瘤基因疫苗182

13.3.1 病毒抗原基因疫苗183

13.3.2 发育肿瘤抗原基因疫苗184

13.3.2.1 癌胚抗原基因疫苗184

13.3.2.2 人绒毛膜促性腺素β亚单位基因疫苗184

13.3.3 理化因素相关肿瘤的基因疫苗185

13.3.4 癌／原癌基因疫苗186

13.3.5 特异抗体可变区基因疫苗187

13.3.6 细胞因子基因疫苗187

13.3.7 MHC基因疫苗187

13.3.8 MUCl等黏附蛋白基因疫苗188

13.3.9 RNA疫苗188

13.3.10 肿瘤基因疫苗靶向治疗189

13.3.10.1 肿瘤内免疫基因疫苗191

13.3.10.2 靶基因组织特异表达191

13.3.10.3 受体介导191

14 控制动物生产性能的基因疫苗192

14.1 蛋白质抗原性分析方法192

14.1.1 蛋白质分析软件192

14.1.2 ANTHEPROT应用方法193

14.1.2.1 工具栏与基本功能193

14.1.2.2 蛋白质序列编辑功能194

14.1.2.3 蛋白质基本分析功能195

14.1.2.4 结果的输出以及与其他应用程序进行数据交换203

14.2 抑制素基因疫苗206

14.2.1 抑制素常规疫苗206

14.2.1.1 抑制素来源206

14.2.1.2 抑制素主动免疫提高家畜排卵率207

14.2.1.3 抑制素被动免疫提高家畜排卵率208

14.2.2 抑制素基因疫苗209

14.2.2.1 抑制素真核表达质粒的构建209

14.2.2.2 抑制素基因免疫209

主要参考文献212